关键词： 多胺类；HL₆₀细胞；细胞凋亡；基因表达；二氟甲基鸟氨酸

【摘要】目的克隆多胺生物合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)诱导HL₆₀细胞凋亡的相关基因，分析该基因表达及诱导凋亡的活性。方法采用差示杂交法筛选目的基因克隆；以Northern杂交、形态观察、流式细胞光度法(FCM)分析及DNA电泳梯形图，分别证明转染细胞中该基因表达及凋亡诱导。结果成功地克隆了DFMO诱导HL₆₀细胞凋亡的相关基因dF4，并证明了dF4在转染细胞中的表达及其诱导凋亡的活性。结论提示本研究克隆的dF4基因可能是与调控HL₆₀细胞凋亡有关的基因。

Cloning and expression of a gene associated with HL₆₀ cell apoptosis induced by inhibition of polyamine biosynthesisFeng Lixin, Fan Muzhen. Department of Biochemistry and Molecular Biology, China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029

【Abstract】ObjectiveTo clone the gene associated with apoptosis induced by an inhibitor of polyamine biosynthesis, α-difluoromethylornithine (DFMO).MethodsThe differential substraction screening was used for gene cloning. The gene expression and apoptosis of transfected HL₆₀ cells were detected by Northern blot, morphological assay, FCM and ladder map of DNA electrophoresis, respectively.Results An apoptosis-associated gene named dF4 was cloned from HL₆₀ cells treated with polyamine biosynthesis inhibitor. The programmed cell death was demonstrated in the HL₆₀ cells transfected by dF4 gene.ConclusiondF4 gene cloned in this study could be a gene regulating apoptosis of HL₆₀ cells.

【Subject words】PolyaminesHL₆₀cellApoptosisGene expressionDifluoromethylornithine

抑制多胺生物合成诱导细胞分化和凋亡的相关基因事件中，肿瘤细胞是否有某些被封闭的基因被启动表达，而引起肿瘤恶性表型逆转?为了探讨这一问题，我们试图从构建的多胺生物合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)诱导分化与凋亡的HL₆₀细胞cDNA文库中，筛选克隆出被诱导启动表达的基因，并对其表达及诱导凋亡活性进行初步分析。

材料与方法

1.细胞培养：HL₆₀ 细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，置37℃，0.5% CO₂恒温箱培养，用含6 mmol/L DFMO 的上述培养基进行HL₆₀细胞分化，凋亡诱导实验，每天收集细胞计数，Giemsa染色后观察细胞形态。

2.DNA断裂电泳分析（按常规方法进行）：收集约10⁶细胞，加裂解液（50 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA, 0.5%SDS)及蛋白酶K，置60℃ 2小时，冷至室温，加等体积酚抽提1次，酚/氯仿抽提1次，加0.1体积3 mmol/L 醋酸钠及2倍体积无水乙醇沉淀DNA，真空干燥后溶于TE缓冲液（pH8.0），在1.6%琼脂糖凝胶电泳。

3.cDNA文库构建：参照文献［8］进行。提取诱导分化与凋亡的HL₆₀细胞总RNA，用Xba I—引物接头引导合成cDNA第1链，随后合成第2链、甲基化EcoR I位点、加上磷酸化EcoR I—连接子，用EcoR I及Xba I酶切后的cDNA片段与经相同酶切后的载体Lambda GEM-4连接、包装，以LE392为宿主菌。

4.诱导分化细胞表达的相关基因筛选和克隆：

(1)差示杂交探针制备：DFMO诱导分化的HL₆₀细胞总RNA经³²P-dCTP参入逆转录反应，酚/氯仿抽提，G-50柱纯化，得到纯化的³²P-cDNA与HL₆₀细胞mRNA杂交。经羟基磷灰石柱分离，0.16 mmol/L磷酸钠洗脱并收集未被杂交结合的cDNA, 检测放射比活，以此作为差示探针。

(2)筛选阳性克隆：按常规法取cDNA文库包装液稀释铺板转膜，与³²P标记差示探针杂交，放射自显影后找出阳性克隆（dF），阳性克隆噬菌斑原位转膜杂交再筛选。

5.目的基因真核表达质粒的构建^［8］：

（1）按常规方法扩增阳性克隆（dF）噬菌体，提取其DNA,用EcoR I 和Xba I酶切鉴定。

（2）真核表达载体pRc/CMV连接臂的制备：扩增pRc/CMV,分别用EcoR I/pst I和Xba I/pstI酶切,低融点琼脂糖凝胶电泳回收连接臂DNA。

（3）阳性克隆cDNA与连接臂DNA重组及阳性克隆鉴定：阳性克隆cDNA片段与连接臂DNA在T4连接酶作用下，连接重组后转化感受态细菌HB101，经培养扩增、提取重组质粒DNA，并经酶切鉴定，得到真核表达质粒pCMV/dF。

6.阳性重组体转染HL₆₀细胞，筛选转染克隆细胞：用磷酸钙法^［8］将含有dF克隆的真核表达质粒pCMV/dF转染HL₆₀细胞，经G418抗性筛选，得到转染的细胞克隆pCMV/dF-HL₆₀。

7.Northern杂交：用³²P标记dF4片段作探针, 按常规方法进行。

8.细胞凋亡峰(ap)检测用FCM法

结果

1.DFMO诱导分化的HL₆₀细胞cDNA文库构建：按前述方法构建DFMO诱导分化的HL₆₀细胞cDNA文库，其滴度检测证明文库大小为2.85×10⁶克隆/μg mRNA。完全符合要求。

2.阳性克隆筛选：取上述文库约1 000个噬菌体转至硝酸纤维膜上，共30张膜（约30 000克隆）用³²P标记的差减探针与之杂交，进行第1轮筛选，放射自显影显示阳性克隆，第1轮阳性克隆稀释后进行第2轮筛选，得到的阳性噬菌体DNA点2张

A: 与分化的HL₆₀ cDNA杂交B:与HL₆₀ cDNA杂交

图1阳性克隆斑点杂交图

膜，分别与HL₆₀细胞和分化的HL₆₀细胞的cDNA探针杂交。结果显示，在第2轮筛选的23个克隆中，有9个阳性克隆，分别命名为dF1～dF9（图1）。

3.真核细胞表达重组体pCMV/dFs的构建：pRc/CMV质粒经EcoR I/pst I和Xba I/pstI酶切的片段与EcoR I/Xba I酶切的Lambda GEM-4/dF片段连接重组，经酶切电泳图谱鉴定证明，得到pCMV/dFs重组质粒，dF1～dF9插入片段大小，均在1.7～2.3kb范围内。其中pCMV-dF4质粒插入片段大小为2.1kb。

4.pCMV-dF4转染HL₆₀细胞（pCMV/dF4-HL₆₀）的生长抑制和凋亡诱导：(1)分别用pCMV/dF1～pCMV/dF9，9个克隆重组质粒分别转染HL₆₀细胞，其中pCMV/dF4转染细胞的生长受到明显抑制

图2pCMV/dF4-HL₆₀细胞生长曲线

A：HL₆₀细胞B：pCMV/dF4-HL₆₀细胞(转染后96小时)C：pCMV/dF4-HL₆₀细胞(转染后148小时)D：pCMV/dF4-HL₆₀细胞(转染后172小时)

图3pCMV/dF4-HL₆₀细胞形态

（图2），而其余8个克隆重组质粒转染的细胞，其生长速率没有变化。(2)pCMV/dF4-HL₆₀细胞Wright-Giemsa染色光镜观察，96小时后开始有细胞染色质浓缩并靠近核膜，染色质断裂，核膜崩解（图3），呈凋亡细胞形态。(3)转染细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳显示，DNA断裂成200bp及其倍增片段，呈梯状图谱(图4)。(4)转染细胞的FCM法分析图谱显示有ap峰出现，且随转染时间的延长，ap峰明显增多。(5) Northern杂交法检测 pCMV/dF4-HL₆₀细胞中有dF4基因表达。

图4pCMV/dF4-HL₆₀细胞DNA电泳分析

讨论

多胺代谢调控在细胞增殖与分化中起着重要作用^［1］，正常细胞的恶性转化与多胺代谢异常密切相关^［2］。我们过去的工作不仅证明了多胺生物合成的关键酶-鸟氨酸脱羧酶（ODC）的不可逆抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）能抑制肿瘤细胞增殖，诱导其细胞分化和凋亡，减低或消除肿瘤细胞致瘤性，其机制与其对肿瘤相关基因表达调控有关^［3～6］，而且突变的癌基因Ha-ras^val12转化的细胞HR-1用DFMO处理后，其转化表型发生逆转，但在DFMO处理的同时加入外源<