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【摘要】目的探讨肿瘤细胞转移潜能与72000IV型胶原酶的关系。方法采用明胶酶谱分析法，检测两组5种不同转移潜能的人癌细胞系，分泌72000IV型胶原酶的情况，以及人正常纤维母细胞在不同癌细胞的作用下，分泌的72000IV型胶原酶活性的改变。结果高转移潜能的癌细胞(PG、WM451和WM983a)分泌72000IV型胶原酶的量明显高于低转移潜能的癌细胞(PAa和WM35)；在受PG和WM451细胞作用的纤维母细胞的条件培养液中，活化型72000IV型胶原酶的产量明显高于其他癌细胞作用的纤维母细胞。结论72000IV型胶原酶的表达和分泌与肿瘤细胞的转移潜能密切相关；高转移潜能的癌细胞(PG)和转移瘤细胞(WM451)可能通过分泌某些可溶性介质，刺激纤维母细胞，促进酶原型72000IV型胶原酶的活化，从而更有效地降解IV型胶原，达到转移的目的。
A study on the correlation between the activity of 72000 type IV collagenase and the metastatic potential of cancer cellsGao Qing, Wu Bingquan, Zhong Haohao, et al. Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083
【Abstract】ObjectiveTo evaluate the enzyme activity of 72000 type IV collagenase and its relationship with the metastatic potential of cancer cells.MethodsThe levels of secreted 72000 type IV collagenase in the conditioned media of five human cancer cell lines with different metastatic potential and a normal lung fibroblast strain treated with cancer cell culture media were examined by gelatin zymography and densitometric analysis.ResultsThe levels of 72000 type IV collagenase secreted by cancer cells with high metastatic potential (PG, WM451 and WM983a) were higher than those secreted by cancer cells with low metastatic potential (PAa and WM35). In the conditioned media of fibroblasts which were treated with the culture media of PG and WM451, enhanced levels of activation were observed.ConclusionThe secretion of 72000 type IV collagenase is closely correlated to the metastatic potential of cancer cells. The cancer cells with high metastatic potential may possibly through certain soluble mediators stimulate normal fibroblasts to activate 72000 type IV procollagenase.
【Subject words】72000 IV type collagenaseNeoplasm metastasisTumor cells, culturedFibroblast
溶解、穿越基底膜是癌细胞侵袭和转移过程中的重要环节，而基底膜的主要纤维成分是IV型胶原。72000IV型胶原酶，又称明胶酶A，是降解IV型胶原的一种蛋白水解酶，它以水溶性酶原形式分泌至胞外，经活化，脱去约10 000左右的前肽，才具有酶活性。对人体肿瘤组织的研究表明，肿瘤细胞及其周围的间质细胞均能产生72000IV型胶原酶。我们采用酶谱分析(zymography)的方法，检测两组不同转移潜能的人癌细胞系所分泌的72000IV型胶原酶的活性，以及正常纤维母细胞在不同肿瘤细胞的作用下，分泌的72000IV型胶原酶活性的改变，探讨72000IV型胶原酶活性与肿瘤细胞转移潜能的关系。
材料与方法
1.细胞系：PAa是人肺腺癌细胞系，裸鼠体内转移能力较低；PG是高转移性人巨细胞肺癌细胞系［1］。WM系列是从不同病变阶段分离培养的人黑色素瘤细胞系，WM35取自早期未发生转移的病变；WM983a来自进展期已经发生转移的病变；WM451则直接取自转移瘤［2］。HEL是人正常肺纤维母细胞。
所有细胞均在100 ml培养瓶内，于37℃，5%CO2，湿度恒定孵育箱内培养。培养液：PAa、PG是含10%小牛血清的RPMI1640；WM系列为含15%小牛血清的RPMI1640；HEL是含10%小牛血清的DMEM。
2.癌细胞条件培养液的收集：正常传代的癌细胞，当长满80%瓶底面积时，去除含血清培养液，用不含血清的培养液洗3遍后，加入等量的不含血清的RPMI1640培养液，继续培养24小时后，收集培养液并活细胞计数。所收集的培养液，经1 200×g、4℃离心10分钟，0.22 μm滤膜过滤，以细胞数为依据调整体积，分装后立刻进行酶谱分析或存于-70℃，用于研究对纤维母细胞作用的癌细胞条件培养液的收集。正常传代的癌细胞，长至80%满时，收集培养液并活细胞计数，培养液处理同上。根据细胞数调整体积，分装后立刻进行下一步实验或存于-70℃。
3.纤维母细胞条件培养液的收集：接种等量HEL细胞(约3×105)，24小时后加入等量的癌细胞条件培养液(占总体积1/3)，对照瓶中加入等量的含血清的培养液，继续培养，培养液的收集和处理同癌细胞。
4.酶谱分析：将细胞条件培养液上样于8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶(胶中含1 mg/ml的明胶，明胶是IV型胶原酶底物)，20 mA恒流电泳，电泳后，将凝胶于2.5% Triton-X100液内振摇37℃，1小时；酶缓冲液(50 mmol/L Tris, pH7.5、200 mmol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、0.02% Brij-35)内孵育37℃，16小时；0.5%考马斯亮蓝染色，30%甲醇、10%乙酸脱色，干燥保存［3］。72000IV型胶原酶呈现为蓝色背景下的透明条带，酶原型72000IV型胶原酶位于72000处，而活化型72000IV型胶原酶在62000位置。
5.图像分析：运用德国产LEICA Q550IW图像分析仪对图像进行吸光度(A，曾称光密度OD)测定，计算各条带的积分A值(积分A值=平均A值×面积)［4］。
结果
5种癌细胞分泌72000IV型胶原酶的结果见图1。癌细胞条件培养液中的72000IV型胶原酶主要以酶原形式存在，PG、WM451和WM983a分泌的酶量明显高于PAa和WM35。各条带的积分A值比较见图2。
HEL细胞在不同癌细胞作用下，分泌72000IV型胶原酶的情况见图3。PG和WM451条件培养液作用下的HEL细胞培养液中，含有较明显的活化型72000IV型胶原酶(62000)，而在其他癌细胞作用下的HEL细胞培养液中，活化型72000IV型胶原酶含量较少。活化型72000IV型胶原酶的积分A值占全部72000IV型胶原酶(酶原型+还原型)积分A值的比率见图4。
在酶谱分析的酶缓冲液中，若加入IV型胶原酶的抑制剂EDTA(终浓度10 mmol/L)，其他条件和过
图15种癌细胞系分泌72000Ⅳ型胶原酶的酶谱分析结果
图2图1中酶原型72000Ⅳ型胶原酶各条带积分A值的比较
图3HEL细胞在不同癌细胞条件培养液作用下分泌72000Ⅳ型胶原酶的酶谱分析结果
图4HEL细胞在不同癌细胞作用下产生活化型72000Ⅳ
型胶原酶占全部72000Ⅳ型胶原酶的比率比较
程不变，则无条带显出。实验重复1～3次，所得结果具有相同趋势。明胶酶谱分析在检测72000IV型胶原酶的同时，也能检测92000IV型胶原酶，在本研究实验体系下，检测到各细胞系的92000IV型胶原酶的表达水平很低。
讨论
本研究首先检测了不同转移潜能的癌细胞系72000IV胶原酶的分泌情况，高转移潜能的细胞系PG、WM451和WM983a分泌的IV型胶原酶活性明显高于低转移潜能的癌细胞系PAa和WM35，提示肿瘤细胞转移潜能与其分泌72000IV胶原酶的能力密切相关，这种相关性同样见于人体肿瘤组织的研究［5，6］。
肿瘤细胞在转移过程中，总是和间质细胞相互作用、相互影响的。在人体肿瘤组织的研究发现，肿瘤细胞周边的间质细胞也能合成72000IV型胶原酶［7］，提示肿瘤细胞可以利用间质细胞产生的胶原酶，降解细胞外基质，达到侵袭和转移的目的。本研究通过检测正常纤维母细胞HEL在不同癌细胞的条件培养液作用下，分泌的72000IV型胶原酶的活性，发现在PG和WM451条件培养液作用下的HEL的培养液中，含有较显著的活化型72000IV型胶原酶(62000)，而在其他癌细胞条件培养液或无癌细胞的作用下，HEL培养液中的活化型72000IV型胶原酶含量较少，几乎检测不到。在体内，只有活化型72000IV型胶原酶才能降解IV型胶原，从而说明，同低转移潜能的癌细胞(如PAa、WM35)与原发瘤(如WM35、WM983a)相比，高转移潜能的癌细胞(如PG、WM451)与转移瘤细胞(如WM451)，具有较高的刺激纤维母细胞产生活化型72000IV型胶原酶的能力，更能有效地利用酶原型72000IV型胶原酶。
