关键词： 肿瘤转移抗原，人血小板血小板活化细胞粘附分子流式细胞术

【摘要】目的观察恶性肿瘤患者血小板粘附分子的表达和血小板激活状态，探讨血小板功能异常与肿瘤发展的规律，为临床治疗提供依据。方法采用流式细胞术对50例健康志愿者和181例恶性肿瘤患者血小板表面抗原的表达进行检测，对比正常人与早、中晚期肿瘤患者血小板粘附分子表达和血小板激活状态的异同。结果与正常人相比，肿瘤患者血小板CD42a的表达减少，TSP和CD36的表达增强，CD36⁺TSP⁺、CD36⁺TSP^-、CD9⁺、CD31⁺、CD62⁺CD63^-、CD62⁺CD63⁺、CD62^-CD63⁺血小板的比例增加。中晚期与早期肿瘤患者间的上述差异很明显；早期肿瘤患者与正常人间的差异则不显著；肿瘤患者血小板CD41的表达与正常人相比未显示不同。结论肿瘤患者尤其是中晚期肿瘤患者血小板粘附分子的表达和释放增加，处于激活状态。

Clinical observation on the adhesion molecule expression and functional study of platelets in cancer patientsZhang peitong, Pei Yingxia, Piao Bingkui, et al. Tumor Department, Guanganmen hospital, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100053

【Abstract】ObjectiveTo investigate adhesion molecule expression and functional status of platelets in cancer patients and their relation to cancer progression.MethodsUsing flow cytometry to measure the expression of surface antigens and functional status of platelets in 50 healthy donors and 181 cancer patients.ResultsComparing with normal donors, the expression of CD42a in cancer patients decreased, and that of TSP and CD36 increased. The number of platelets with CD36⁺TSP⁺, cD36⁺TSP^-, CD9⁺, CD31⁺, CD62⁺CD63^-, cD62⁺CD63⁺, CD62^-CD63⁺ phenotypes also increased. There was significant difference between patients in early stage and those in advanced stage, but there was no significant difference between the patients in early stage and healthy donors. The expression of CD41 did not change in cancer patients.ConclusionIn cancer patients, especially in the advanced stage of the disease, the expression of the adhesion molecules on platelets and their released products increase, indicative of an activated state of the platelets.

【Subject words】Neoplasm metastasisAntigens, human plateletPlatelet activationCell adhesion moleculesFlow cytometry

肿瘤细胞成功的转移需要血小板的帮助，血小板对肿瘤细胞血行转移的所有中间步骤都有促进作用^［1］。30%～60％的癌症患者，尤其是晚期患者有血小板增多症，这与患者的不良预后有关^［2］。95％的肿瘤转移患者拥有一项或多项实验室检查的凝血异常，而这些异常的发生大多由肿瘤细胞诱导的血小板激活或血小板激活后的释放产物引起^［3］。既往对恶性肿瘤患者血小板糖蛋白表达异常很少描述，我们采用流式细胞术对比测量肿瘤患者与健康供血者的血小板粘附分子和血小板激活状态，在分子水平上探讨肿瘤患者血小板功能的异常与肿瘤发展的规律，为临床治疗提供依据。

材料与方法

一、样本的选择及一般情况分析

正常人为不同年龄的健康志愿者，1周内未服用过任何抗血小板药物。恶性肿瘤病例全部选自1995年11月至1996年12月间在我院肿瘤科住院患者，均有明确的诊断及分期。健康志愿者50例，年龄23～68岁，平均42.7岁。肿瘤患者181例，年龄24～81岁，平均60.0岁。其中乳腺癌24例，食管癌7例，肾癌5例，肝癌17例，肺癌74例，胰腺癌7例，胃恶性肿瘤21例，大肠癌15例，子宫体癌1例，非何杰金氏淋巴瘤2例，前列腺癌1例，卵巢癌1例，黑色素瘤1例，原发灶不明的转移癌2例，膀胱癌1例，脑瘤1例，胸壁恶性纤维组织细胞瘤1例。各种肿瘤患者I期14例，II期32例，III期51例，IV期84例。I期与II期称早期，III期与IV期称晚期。

二、正常人及肿瘤患者血小板表面抗原的检测

1.试剂：单克隆抗体IgG1 fITC(679.1Mc7)、IgG1 pE(679.1Mc7)、CD9 fITC(ALB6, IgG1)、CD31 fITC(5.6E, IgG1)、CD36 fITC (FA6.152, IgG1)、TSP pE(P10,IgG1)、CD41 pE(P2, IgG1)、CD42a fITC(Beb1, IgG1)、CD62 pE (CLBThromb/6, IgG1)、CD63 fITC (CLBGran /12, IgG1)，除CD42a fITC来自美国BD公司外，其余均来自法国Immunotech公司；标准校正荧光微球(美国BD公司)；2%PBS小牛血清(新生牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所出品)；终浓度1%PFA(PFA为北京化学试剂公司出品，分析纯)。

2.检测方法：健康志愿者及肿瘤患者清晨空腹抽取静脉血3 ml，取后2 ml置硅化试管中，以3.8%的柠檬酸钠(1:9，V/V)抗凝，取自然沉降的PRP按常规分别以CD42a fITC/CD41 PE、CD36 fITC/TSP PE、CD63 fITC/CD62 PE单克隆抗体进行双标记染色，CD9 fITC和CD31 fITC单克隆抗体进行单标记染色，分别以IgG1 fITC/IgG1 PE做同型阴性对照，染色基质为2% pBS小牛血清，染色在暗处进行，室温20分钟。染色完毕后即以终浓度1% pFA固定待测。

测定采用美国BD公司出品FACSort流式细胞仪。以标准校正荧光微球校正机器后，先以前向角和侧向角散射光形成的对数散点图在血小板位置设定收集门，以固定条件收集样本。每个样品管收集10⁴个血小板进行分析。采用Macintosh quadra 650计算机和Cell quest软件收集处理样品数据。

3.机器测试条件：FSC电压E00，增益1.00，对数；SSC电压347MV，对数；FL1电压674 mV，对数；FL2电压517MV，对数；荧光补偿FL1-0.8%FL2，FL2-24.6%FL1；激光功率15mW，激发光波长488nm。

三、统计分析方法

测试结果采用非参数统计方法。正常人与肿瘤患者测试结果的对比采用Mann-Whitney u检验，正常人与早、晚期肿瘤患者之间的对比采用Kruskal-Wallis aNOVA检验。所有统计均采用StatSoft公司的STATISTICA release 4.5统计软件进行统计。

结果

1.正常人与恶性肿瘤患者血小板粘附蛋白表达状况的对比：

结果显示，正常人CD42a⁺CD41⁺血小板CD42a的表达高于肿瘤患者；而肿瘤患者CD36⁺TSP⁺、CD36⁺TSP^-、CD9⁺、CD31⁺、CD63^-CD62⁺、CD63⁺CD62⁺、CD63⁺CD62^-血小板的数目偏高，CD36⁺TSP⁺血小板CD36和TSP的表达均比正常人高，CD36⁺TSP^-血小板CD36的表达也比正常人高。

2.正常人与早、晚期恶性肿瘤患者血小板粘附蛋白表达状况的对比：从正常人与早、晚期肿瘤患者血小板表面抗原表达状况的分别对比发现，CD42a⁺CD41⁺血小板的数目相互间没有差别。CD42a⁺CD41⁺血小板CD42a的表达在晚期肿瘤患者最低，早期患者次之，正常人最高，表明随着病情加重，CD42a的表达也随之降低。CD36⁺TSP⁺血小板的数目晚期患者最高，早期患者次之，正常人最低，相互之间均有统计学差异。CD36⁺TSP⁺血小板CD36的表达在晚期患者与正常人之间存在差异。CD36⁺TSP⁺血小板TSP的表达晚期患者最高，早期患者次之，正常人最低，CD36⁺TSP⁺血小板TSP的表达在早、晚期患者间，晚期患者与正常人间均有统计学差异。CD36⁺TSP^-血小板的数目在晚期肿瘤患者与正常人之间差异显著，晚期肿瘤患者高于正常人。CD36⁺TSP^-血小板CD36的表达在早期患者与晚期患者间，晚期患者与正常人之间的差异都很显著，晚期患者高于早期患者，早期患者高于正常人，但早期患者与正常人比较，无统计学差异。CD9⁺、CD31⁺血小板的数目在早期与晚期患者之间的差异不显著，但在早、晚期患者其检测值均比正常人要高，有统计学差异。血小板CD9和CD31的表达在正常人与早、晚期患者间未显示差别。CD63^-CD62⁺、CD63⁺CD62⁺血小板的数目在晚期患者、早期患者与正常人间逐次降低，相互之间均有统计学差异。CD63⁺CD62^-血小板的数目在晚、早期及正常人间也逐次降低，在早、晚期患者间还没有统计学差异，但早、晚期患者分别与正常人相比有统计学差异。CD63^-CD62⁺血小板CD62、CD63⁺CD62⁺血小板CD63和CD62、CD63⁺CD62^-血小板CD63的表达在早、晚期肿瘤患者、正常