外阴上皮内瘤变(VIN)被视为癌前病变，目前许多研究表明，其与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关。HPV感染后是否会诱发p53和BCL-癌基因的变化，我们采用PCR和免疫组化方法对此进行了研究。

材料与方法本组22例外阴上皮内瘤变组织均为本院妇科手术切除后制备的石蜡标本。其中Ⅰ级15例，Ⅲ级7例。PCR方法检测HPV DNA：(1)寡核苷酸引物：由上海复生生物技术研究所提供。其中包括扩增HPV₆，11型基因的两对引物，扩增HPV₁₆，18型两对引物。(2)DNA制备：切取10 μm厚组织切片4～8张，二甲苯脱蜡，无水乙醇洗涤，在消化裂解液中50℃卵育24～48小时，消化液即为所需样品DNA。(3)PCR反应：50 μl反应混合物含3 μl DNA样品、2 UTaq酶，每种引物120 μmol/ dNTPS和PCR缓冲液。循环35次，条件设定：HPV₆，11为94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，45秒。HPV 16，18为94℃，60秒；55℃，60秒；72℃，90秒；最后1个循环结束后置72℃，5分钟。扩增产物电泳，照相。免疫组化采用ABC方法，p53，BCL-2及HPV16，18 E6单抗系美国santa cruz公司产品。

结果22例中，以HPV16，18型引物扩增，11例电泳时出现2条144bp和263bp扩增带，显示HPV16，18阳性。4例电泳时出现1条230bp扩增带，显示HPV6，11阳性。其中1例同时检出PHV6，11和HPV16，18。在10例单纯HPV16，18阳性标本中，4例有HPV16，18 E6抗原表达，阳性角肮细胞多散在位于表皮的中上部，表现为细胞核、质共染或胞质处阳性。本组22例中，8例p53蛋白阳性，阳性角肮细胞主要位于表皮的中下部，表现为细胞核或核、质共染。10例BCL-2蛋白阳性，且均为Ⅰ级，阳性角肮细胞多位于表皮中下部，表现为细胞质着色。在10例Bcl-2阳性病例中，同时伴p53蛋白表达有6例，伴E6蛋白表达的3例。

讨论VIN的HPV感染率为59%～90%，主要以HPV16，18为主。本组22例VXN中，11例HPV16，18阳性，4例HPV6，11阳性，与文献报道结果相一致。但不是所有HPV16，18 DNA阳性病例均有E6蛋白表达，我们仅测出40%病例E6蛋白阳性，可能与检测手段的敏感性低和细胞内的HPV病毒为非活化状态有关。一些基础分子生物学实验表明，HPV16，18等高危病毒的编码蛋白如E6、E7等可分别与抑癌基因蛋白p53和Rb结合，并导致角肮细胞的增殖分化失控，诱发癌变。p53基因的突变或降解失活均可诱发细胞增殖。我们用免疫组化方法测得的p53蛋白均为突变型的基因表达，阳性率为36.4%。说明p53基因突变在VIN中可能发挥一定作用，VIN具有潜在的恶变因素。Wernes等提出，HPV16，18的E6蛋白可与细胞内野生型p53蛋白结合形成复合物，导致p53的降解和失活。本实验结果表明，在组织切片中E6蛋白的表达多位于表皮的中上部，而p53蛋白表达却位于表皮的下部，表明组织中E6蛋白的表达与p53的异常表达之间可能并无必然的联系。

Bcl-2是从B淋巴细胞瘤中首先分离出的一种原癌基因，其产物可抑制细胞凋亡，导致肿瘤发生，目前认为是一种广义的抑凋亡基因。本实验中，VINⅠ级Bcl-2蛋白高表达，阳性率为66.7%；而Ⅲ级全部阴性。提示在外阴上皮内瘤变中，随着异型性增加，Bcl-2表达下降，Bcl-2在病变早期起重要作用。另外，在组织切片中观察到Bcl-2蛋白表达多位于表皮的中下部，与E6蛋白表达之间关系不大，表明Bcl-2过表达不是由人乳头瘤病毒诱导而来的。值得注意的是，在10例Bcl-2阳性病例中，同时伴有p53表达的有6例，且均位于表皮的中下部。ziang等在培养的上皮肿瘤细胞中发现，Bcl-2阳性的肿瘤细胞均为p53失活者，故认为，Bcl-2表达与肿瘤细胞的存活及发展有关。我们的结果也支持这一观点。

(收稿：1997-11-24修回：1997-12-26)