关键词： 白血病逆转录病毒基因转移基因治疗转染聚合酶链反应

【摘要】目的建立安全高效的逆转录病毒介导的基因转移系统，为白血病基因治疗提供实验基础。方法分别用脂质体转染和小鼠逆转录病毒转导方法，将含标志基因Neo^R的逆转录病毒载体pLXSN导入双嗜型包装细胞GP+envAm12，获得重组逆转录病毒；用含病毒上清感染白血病细胞系（NB4、U937和THP-1），并分析对K562细胞的转导效率。结果脂质体DOSPER转染法获得病毒滴度为8.0×10⁵ cFU/ml，而病毒感染法高达1.6×10⁷ CFU/ml。经G418选择，PCR证实Neo^R基因被整合到白血病细胞基因组中，巢式PCR与补救分析均未检测到辅助病毒存在。单个集落K562细胞的PCR分析证实，基因转移效率可达93.3%～100%。结论逆转录病毒介导的基因转移系统是高效、安全的，有助于人类白血病的基因治疗研究。

Efficient gene transfer mediated by retrovirus vector in leukemic cellsFu jianxin, Chen Zixing, Cen Jiannong, et al. Jiangsu Insitute of Hematology, First affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou215006

【Abstract】ObjectiveTo establish an efficient and safe gene transfer system mediated by retrovirus for providing an experimental basis of gene therapy in human leukemia.MethodsThe retrovirus vector pLXSN, carrying the Neo^R, was transferred into amphotropic packaging cell line GP+envAm12 by liposome method or by transduction. retrovirus with higher titer was used to infect human leukemic cell lines NB4, u937 and THP-1. The efficieney of gene transduction was tesed on colonies formed by K562 cells after gene transduction.ResultsThe titer of DOSPER liposome transfected GP+envAm12 pool on NIH3T3 cells was 8.0×10⁵CFU/ml while that of producer pool infected with mouse retrovirus was 1.6×10⁷ cFU/ml. Integration of Neo^R into human leukemic cells was confirmed by PCR. By both nested PCR and Neo^R rescue assay, no helper virus was found. Neo^R gene transfer with the efficiency as high as 93.3 to 100% in K562 cells was verified by semi-nested PCR on the colonies after seven days' culture.ConclusionThe efficiency and safety of the gene transfer system may provide an optimal experimental system in gene therapy for human leukemia.

【Subject words】LeukemiaRetrovirusGene transferGene therapyTransfectionPolymerase chain reaction

基因转移是遗传性疾病或肿瘤基因治疗的分子基础。利用逆转录病毒载体介导将外源性基因导入细胞和动物是目前基因转移的首选方法，并已被多数临床试验方案采用^［1］。我们应用逆转录病毒载体pLXSN，将新霉素耐药基因（Neo^R）导入白血病细胞，以研究对白血病进行基因治疗的可行性。

材料与方法

1.细胞系与病毒载体：人类白血病细胞系(NB4、U937、THP-1与K562)、小鼠逆转录病毒生产细胞GP+E86/Neo^R(滴度为8.1×10⁶ cFU/ml)及NIH3T3均由本实验室保存，双嗜型包装细胞系GP+envAm12由美国哥伦比亚大学医学院Bank博士提供，含标志基因Neo^R的逆转录病毒载体pLXSN（图1）由美国NCI的 cowan博士惠赠。

图1逆转录病毒载体pLXSN结构示意图

2.脂质体介导质粒转染：参照供应商所推荐的方法，用脂质体DOSPER(Boehringer mannheim公司)将pLXSN质粒导入包装细胞中，以0.8 g/L G418(GIBCO/BRL公司)筛选并获得病毒生产细胞阳性克隆。以NIH3T3为受体细胞常规测定病毒滴度。

3. 小鼠病毒感染双嗜型包装细胞：将含8 mg/L聚凝胺(Sigma公司)的GP+E86/Neo^R细胞上清加入GP+envAm12细胞,37℃2小时；换液2次后加入DMEM使聚凝胺降至2 mg/L，继续培养24小时后以0.8 g/L G418选择，获得双嗜型逆转录病毒生产细胞。

4.感染白血病细胞：用双嗜型病毒上清感染白血病细胞系NB4、U937和THP-1，37℃2小时后即换成新鲜RPMI 1640，用G418选择培养。对感染的K562细胞做半固体培养，以检测基因转移效率。

5. K562细胞CFU-L分析：感染的K562细胞于37℃继续培养24小时，按100个细胞培养皿(直径35 mm)在含1%甲基纤维素(Fisher scientific公司）与20%胎牛血清的RPMI1640中进行半固体集落培养。7～10天后，用微量吸管吸取分离良好的单个集落分析基因转移效率。

6. PCR检测Neo^R基因：以快速法制备的3种转导细胞或单集落K562细胞的基因组DNA为模板，用PCR检测Neo^R基因的整合状况。引物序列Neo1:5′-CGT tGT CAC TGA AGC GGG AAG G-3′，Neo2:5′-CCA TGA TAT TCG gCA AGC AGG C-3′，Neo3：5′-CAA gAT GGA TTG CAC GCA- GG-3′（均由上海Sangon公司合成）。转导细胞采用引物对Neo1～2；单集落细胞则采用半筑巢式PCR，即先后用Neo3～2引物对与Neo 1～2引物对扩增。PCR反应参数为：95℃30秒，63℃ 45秒，共30个循环。

7. 筑巢式PCR检测辅助病毒env基因：双嗜型包装细胞内小鼠白血病病毒4070A的env基因PCR引物由复旦大学遗传学研究所卢大儒博士提供^［2］。

8. 补救分析检测辅助病毒：用3T3放大分析检测功能性辅助病毒。将含双嗜型逆转录病毒上清感染NIH3T3细胞，G418选择并传代3次，再用其上清感染NIH3T3细胞，培养48小时后以1∶20传代至含0.8 g/L G418的培养基，继续选择培养2周，观察有无克隆形成。

结果

1.病毒生产细胞的鉴定：经DOSPER介导将pLXSN质粒转染双嗜型包装细胞GP+envAm12，以G418筛选得到多个抗性克隆。以NIH3T3为受体细胞，测得其混合上清中重组病毒滴度为8.0×10⁵ cFU/ml。将具有不同宿主范围ENV的包装细胞GP+envAm12与GP+E86交互感染，发现双嗜型病毒滴度可被提高到1.6×10⁷ cFU/ml。故此“乒乓效应”可显著提高病毒滴度。此外，PCR证实，Neo^R基因已整合到包装细胞GP+envAm12基因组。

2.逆转录病毒介导标志基因转移：用滴度为1.6×10⁷CFU/ml的双嗜型病毒感染NB4、U937与THP-1细胞，筛选并获得NB4/Neo^R,U937/Neo^R与THP-1/Neo^R。PCR证实，3种经转导的细胞均可扩增出Neo^R基因特异的347bp片断，提示Neo^R基因已成功整合至白血病细胞DNA，完成基因标记。

3.基因转导效率分析：在无造血生长因子的条件下，以K562细胞为模型，通过半筑巢式PCR分析单个CFU-L的Neo^R基因整合状况，研究逆转录病毒载体介导的基因转移效率。分3次吸取共35个集落细胞，经PCR分析，显示基因转导效率为93.3%～100%，表明本基因转移系统具有高效性。

4.辅助病毒的检测：在逆转录病毒介导的基因转移中，靶细胞被复制缺陷型病毒感染后应无病毒反式结构基因整合。辅助病毒的筑巢式PCR检测结果如图2所示，3种转导细胞除出现内对照MDR-1的830bp产物外，均未能扩增出env基因，而作为对照的GP+envAm12则出现224bp的阳性条带，表明本基因转移体系中无辅助病毒产生。在补救分析实验中，重组的复制缺陷型病毒仅能将Neo^R基因转移至NIH3T3细胞，后者因无病毒反式结构基因的补救而不能再将Neo^R基因转移至NIH3T3受体细胞，经G418选择后均未见有抗性克隆生长，从功能上证实无辅助病毒的产生，表明该基因转移系统是较为安全的。

1：X174 rF DNA/HaeIII分子量标准；2：GP+envAm12细胞；3：NB4/Neo^R细胞；4：U937/Neo^R细胞；5：THP-1/Neo^R细胞

图2筑巢式PCR扩增辅助病毒env基因

讨论

以CD34^＋造血干/祖细胞或白血病细胞为靶细胞的基因治疗，目前已有多项方案进入临床试验，并显示其广阔的应用前景。尽管高水平的野生型辅助病毒（或称可复制逆转录病毒，RCR）未能在非人灵长类动物引起疾患，但也有人发现RCR可在免疫受抑猴体内引发T细胞淋巴瘤，故须将产生RCR的可能性降至最低。基因转移系统的安全性可从载体与包装细胞两方面进行改进。pLXSN载体的骨架为Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，其序列与病毒反式结构基因的同源性很小，且载体的gag基因起始密码子被定点诱变为终止密码子，并将env基因从载体上切除；而所用包装细胞中起反式互补作用的gag