关键词： 巨噬细胞集落刺激因子干扰素-γ巨噬细胞基因治疗黑色素瘤/治疗

【摘要】目的观察巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和干扰素-γ(IFN-γ)基因单独或联合转染的巨噬细胞（macrophage, M）对局部黑色素瘤的治疗效果及相关免疫机理。方法荷瘤小鼠经基因转染的巨噬细胞治疗后,观察其长期存活期并检测其体内抗肿瘤免疫功能。用4小时 ⁵¹Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞自然杀伤细胞(NK)、细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性，间接MTT法检测荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的杀伤活性，常规方法检测脾细胞诱导上清中肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)活性，局部肿瘤经治疗后行常规病理分析。结果经IFN-γ基因及联合基因转染的巨噬细胞治疗后的荷瘤小鼠有25％能长期存活，体外诱导的CTL和小鼠腹腔巨噬细胞杀伤活性显著增强，脾细胞经诱导产生的细胞因子有不同程度的增加，与对照组相比差别显著。常规病理显示，M-CSF和IFN-γ联合基因转染的巨噬细胞治疗的小鼠肿瘤局部有大量的淋巴细胞浸润。结论M-CSF和IFN-γ基因转染的巨噬细胞瘤内瘤周注射对肿瘤有较好的治疗效果，其机制除了与巨噬细胞在局部直接接触杀伤瘤细胞有关外，宿主抗肿瘤免疫功能的增强亦起了重要的作用。

Antitumor effect of M-CSF and/or IFN-γ gene cotransfected-macrophages by intratumoral injectionLei Hong，Cao Xuetao，Yu Yizhi，et al. Department of Immunology ,The Second Medical Military University，Shanghai 200433

【Abstract】ObjectiveTo investigate the in vivo antitumor effects of M-CSF and/or IFN-γ gene transfected-macrophages and their related immunological mechanisms.MethodsSurvival time and antitumor effects in vivo of tumor-bearing mice treated with gene-transfected macrophages were observed. NK cell and CTL activity was detected with 4hr⁵¹Cr release assay , cytotoxicity of macrophages was detected with indirect MTT methods, activity of IL-2,TNF,IFN-γwere detected by routine methods.Results25% of the tumor-bearing mice after treatment with IFN-γ gene-transfected, M-CSF and IFN-γ gene co-transfected macrophages survived more than 3 month. The CTL and macrophage activity of the tumor-bearing mice was enhanced. Levels of TNF,IL-2,IFN-γ in the supernatants of splenocytes induced in vitro were also increased. Histologic analyses of the tumor tissue after treatment with M-CSF and/or IFN-γ gene-transfected macrophages showed a large amount of lymphocyte infiltration.ConclusionIFN-γ and M-CSF gene co-transfection into macrophages are proved to enhance their antitumor potential efficiently through direct augmentation of their tumoricidal cytotoxicity and induction of host antitumor immunity.

【Subject words】Macrophage colony stimulating factorInterferon-gammaMacrophageGene therapyMelanoma/therapy

体外活化的巨噬细胞回输体内后，由于缺乏持续的刺激因子存在而影响了其抗肿瘤作用的充分发挥，基因转染可以为巨噬细胞的活化提供稳定持久的刺激信号。我们在研究中选择了能维持巨噬细胞长期存活的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和最强的巨噬细胞活化因子——干扰素-γ(IFN-γ)，将其基因转入巨噬细胞，将该巨噬细胞进行瘤内/瘤周直接注射，观察其体内抗肿瘤效果。

材料与方法

1. 小鼠腹腔巨噬细胞的制备与基因转染：方法参见文献［1］。

2. 瘤体内/瘤周注射基因转染的巨噬细胞治疗黑色素瘤的疗效观察： 剔除C57BL/6小鼠右腿后部毛发，每只皮下注射B16.F10肿瘤细胞1×10⁵，在接种点处作标记，3天后以此为荷瘤小鼠模型，随机分为7组，每组8只小鼠用于观察长期存活期，3只用于检测体内功能。对照组包括未经治疗的野生型荷瘤小鼠（未治组）、瘤内瘤周注射RPMI-1640培养基对照(RPMI-1640组)、瘤内瘤周注射正常的未经基因转染的巨噬细胞(M组)、瘤内瘤周注射LacZ对照基因转染的巨噬细胞(M-LacZ组）。实验组包括瘤体内/瘤周注射M-CSF和IFN-γ单独或联合基因转染18小时后的巨噬细胞1×10⁶/只(M-M-CSF, M-IFN-γ, M-M-CSF+IFN-γ),每隔4天治疗1次，共治疗2次，于最后1次治疗后第10天检测其体内抗肿瘤免疫功能的变化，并观察其长期存活期。

3.小鼠脾细胞自然杀伤细胞(NK)活性及经诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的检测: 取最后一次治疗后第10天的荷瘤小鼠的脾细胞检测NK，常规方法诱导CTL^［2］。NK及CTL活性的检测均采用4小时 ⁵¹Cr（购自Amersham公司）释放法，靶细胞分别选用YAC-1细胞和野生型B16.F10黑色素瘤细胞(本室常规传代)，效靶比为100∶1。

4.脾细胞上清中诱导的肿瘤坏死因子(TNF)、IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)活性：将常规方法获取的脾细胞悬液，加入24孔板［5×10⁶/孔，ConA(购自Sigma公司)终浓度为10 μg/ml］，置37℃ 5%CO₂孵箱中培养24,48,72小时收上清，常规方法检测IL-2、TNF、IFN-γ活性。

5. 腹腔巨噬细胞杀伤活性的检测: 采用L1210(本室常规传代)为靶细胞的间接MTT法^［3］。

6. 常规病理学分析: 基因转染的巨噬细胞治疗局部肿瘤，于荷瘤后第17天取接种处组织做组织学检查。

7. 统计学处理：采用未配对计量资料的t检验。

结果

1.荷瘤小鼠经基因转染巨噬细胞局部治疗后的存活期：对照组(未治组、RPMI-1640组、M组、M-LacZ组)的荷瘤小鼠在荷瘤后23天左右全部死亡；M-CSF和IFN-γ基因联合转染巨噬细胞和IFN-γ单基因转染的巨噬细胞治疗组中，25%的小鼠未见肿瘤生长且长期存活；联合基因转染巨噬细胞治疗组的小鼠平均存活期延长。经M-CSF基因转染的巨噬细胞治疗的小鼠，开始时肿瘤的生长受到一定的抑制，但最终仍出现肿瘤生长，且没有小鼠长期存活，可能与巨噬细胞未充分活化有关。

2.荷瘤小鼠脾细胞NK活性的变化: 单独或联合基因转染的巨噬细胞治疗局部肿瘤后，荷瘤小鼠脾细胞NK活性未见显著增加，与对照组相比, 差异无显著性(P＞0.05,图1)。

A：B16.F10；B：RPMI-1640；C：M；D：M-LacZ；E：M-M-CSF；F：M-IFN-γ；G：M-IFN-γ+M-CSF

图1M-CSF或(和)IFN-γ基因转染的M治疗后荷瘤小鼠脾细胞NK活性

3.荷瘤小鼠脾细胞经诱导的CTL杀伤活性:如图2所示，M-CSF治疗组的CTL活性增加不明显(P＞0.05)；IFN-γ单基因转染组治疗局部肿瘤后，荷瘤小鼠的CTL活性与对照组相比显著增加(P＜0.05)；与M-CSF基因联合转染后CTL活性较单基因转染的巨噬细胞治疗组相比显著增加(P＜0.05)；与对照组细胞相比，差异有非常显著性(P＜0.01)。

A：B16.F10；B：RPMI-1640；C：M；D：M-LacZ；E：M-M-CSF；F：M-IFN-γ；G：M-IFN-γ+M-CSF

图2M-CSF或(和)IFN-γ基因转染的M治疗后荷瘤小鼠脾细胞CTL活性

4.荷瘤小鼠脾细胞上清中诱导的TNF-α、IL-2、IFN-γ活性：联合基因转染治疗组脾细胞诱导的TNF、IFN-γ活性显著增加(P＜0.05)，IFN-γ单基因转染组和联合基因转染组的IL-2活性高于对照组(P＜0.05)。M-CSF单基因转染组治疗的荷瘤小鼠脾细胞体外诱导后，TNF-α、IFN-γ、IL-2没有显著增加(附表)。

附表治疗后荷瘤小鼠脾<