关键词： 白血病/药物疗法细胞凋亡DNA，肿瘤/分析流式细胞术

【摘要】目的了解急性白血病患者化疗过程中细胞凋亡的动态变化及意义。方法采用细胞形态学、DNA凝胶电泳、流式细胞计数仪研究20例不同类型急性白血病化疗前后外周血变化。结果化疗过程中外周血白细胞、幼稚细胞明显下降，但无凋亡细胞和DNA ladder形成，DNA含量分析也无亚二倍体峰出现。结论化疗药物诱导细胞凋亡，但在血循环中很快被清除，故不易检测出凋亡细胞，体内研究细胞凋亡较体外更为复杂。

A study on apoptotic cell death during chemotherapy of patients with acute leukemiaRen xinping, Gao Hui, Wang Shenwu, et al. Institute of Hematology, People's hospital, Beijing Medical University， Beijing100044

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether apoptosis occurs in vivo in patients with acute leukemia during induction chemotherapy and its significance.MethodsApoptotic effect on peripheral blood of 20 patients with different types of acute leukemia prior to and during routine chemotherapy was studied by cell morphology, DNA electrophoresis and FCM-DNA analysis.ResultsAfter chemotherapy, with falls in WBC and blast count, no apoptotic cells appeared on smears of peripheral blood, nor did ladder pattern of DNA on electrophoresis and subdiploid peak on FCM.ConclusionAlthough anticancer drugs have been shown to induce apoptosis in vitro, circulating apoptotic cells are hardly detected probably due to their rapid clearance from the circulation. It is more difficult to study apoptosis in vivo than in vitro.

【Subject words】Leukemia/drug therapyApoptosisDNA, neoplasm/analysisFlow cytometry

细胞增生和细胞凋亡间的平衡是多细胞生物体维持自身稳定的重要因素^［1］。细胞凋亡机制的受抑或丧失不仅在白血病的发生中起重要作用，而且与白血病细胞对化疗药物的耐受密切相关^［2］。几乎所有的化疗药物包括阿糖胞苷(Arac)、足叶乙甙(VP-16)、米托蒽醌(NVT)、柔红霉素(DNR)和放射线治疗都可以诱导细胞凋亡，是清除白血病细胞的机制之一^［3］。为了探讨急性白血病体内化疗过程中细胞凋亡的动态变化，我们对20例接受Ara-c、NVT、DNR、VP-16和强的松治疗的初治急性白血病患者的外周血进行研究。结果表明，体内检测细胞凋亡困难，化疗诱导白血病细胞凋亡的体内机制较体外复杂。

材料与方法

1.病例来源：1996年10月～1997年6月我院收治的成人急性白血病20例中，急性髓细胞性白血病(AML)16例，其中M₂7例，M₃ 4例，M₄1例，M₅ 3例，M₆1例；急性淋巴细胞性白血病(ALL)4例。AML-M₃给予反式维甲酸60 mg/d诱导缓解治疗，其余AML患者均给予标准DA或NA化疗方案(Ara-c150～250 mg/d，5～7天；DNR40～60 mg/d,2～3天；NVT10～20 mg/d，2～3天)。ALL患者给予VDP方案(VCR2 mg/d，1次；PRED 40～60 mg/d，21天；DNR 40～60 mg/d，1～2天)。分别于治疗前及化疗后1周内采集患者外周血，对AML-M₃患者则于ATRA治疗后第7，10，14，18，21天继续采集外周血，淋巴细胞分层液分离收集单个核细胞。

2.DNA抽提及电泳：按Preston法^［4］提取，1.5%琼脂糖凝胶，60V电泳2小时，紫外灯下观察照相。

3.FCM检测凋亡细胞：取5×10⁵细胞，70%冷乙醇固定过夜，上机前洗去乙醇，加入0.5 ml磷酸盐柠檬酸缓冲液(192∶8的0.2 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L柠檬酸，pH7.8)，室温30分钟；加入终浓度50μg/ml RNase A，室温30分钟；再加入终浓度为50μg/ml PI避光染色30分钟，上机检测。与化疗前对照相比，低于G₀/G₁期DNA含量细胞为凋亡。

结果

1.化疗后外周血白细胞数和原始幼稚细胞的改变：化疗后外周血白细胞数明显下降，由化疗前91.8×10⁹/L～5.2×10⁹/L(中位数13.8×10⁹/L)降至化疗后7天13.0×10⁹/L～2.2×10⁹/L(中位数6.5×10⁹/L)；外周血幼稚细胞数由82.6×10⁹/L～4.1×10⁹/L降至10.3×10⁹/L～3.3×10⁹/L，提示体内有大量白血病细胞死去。

2.细胞形态和DNA电泳以及FCM检测DNA含量分析：化疗后第6，12小时以及第1，2，3，4，5，7天未见典型形态学的染色质浓缩和凋亡小体的形成(图1a)。DNA电泳未见180bp～200bp倍数的凋亡“梯子”现象。FCM无亚G₀/G₁期细胞出现。

3.化疗药物体外对细胞的作用：同时以4，10，20，40，100μg/ml VP-16于体外作用于5×10⁵/ml白血病细胞24小时，所有细胞均于10～40μg/ml时开始出现染色质浓缩现象(图1b)，FCM显示低于G₀/G₁期含量凋亡细胞峰出现(凋亡细胞的比例随剂量增加而增多)，并随药物剂量增加而出现DNA“梯子”带(图2)。

1～3药物剂量分别为20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml

图2不同剂量VP-16作用24小时后DNA电泳

讨论

细胞凋亡是不同于细胞坏死的细胞死亡方式之一，它在控制细胞增殖、白血病的发生和发展中起重要作用。药理学研究表明，许多化疗药物均能诱导肿瘤细胞凋亡，这为肿瘤化疗提供了新思路。如何诱导肿瘤细胞凋亡、能否将诱导细胞凋亡作为评价化疗药物敏感性的指标、能否通过对患者化疗早期白血病细胞凋亡的检测判断化疗疗效成为目前研究热点。

我们对20例急性白血病患者化疗期间细胞凋亡情况的研究结果显示，尽管体外用化疗药物能诱导出凋亡细胞，且体内化疗使外周血白细胞和幼稚细胞显著下降，但在体内的研究结果却显示无明显细胞凋亡证据。这与Johnston等^［5］和Matsubara等^［6］的报道一致。目前造成此结果的机制尚不完全清楚，可能的原因有(1)凋亡持续时间相当短(1～3小时)，在能被检测之前，已经被血循环中的网状内皮系统清除。由于凋亡持续时间短，增加其检测难度。(2)体内大剂量的化疗可能以直接杀死肿瘤细胞方式为主。(3)形态学、DNA电泳、DNA含量分析的方法检测早期的凋亡细胞不够敏感。(4)体内存在抑制凋亡的其他机制。有报道造血细胞因子能抑制AML联合化疗引起的细胞凋亡，Bcl2高表达也可以阻断许多因素引起的细胞凋亡。但本研究结果化疗后幼稚细胞数目的显著下降不支持此种机制。

我们的研究结果显示，体内检测细胞凋亡较体外困难，体内细胞凋亡的动力学机制尚不完全清楚。体内细胞的凋亡是化疗药物某一时间作用的结果还是药物累积作用的结果，各类化疗药物作用于肿瘤细胞的凋亡动力学改变是否相同，能否找到一种常规快速而敏感的早期检测方法都有待于进行深入和细致的研究。

图1体内、体外化疗药物作用后形态学观察

a：ALL患者体内VDP化疗后第3天b：ALL患者VP-16 40ug/ml作用24小时（瑞氏染色×1000）

参考文献

1Korsmeryer SJ. regulators of cell death. Trends Genet, 1995, 11:101-105.

2Fisher DE. Apoptosis in cancer therapy crossing the threshold. Cell, 1994, 78: 539-542.

3Gorczyca W, Gong J, Ardelt B, et al. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. cancer Research, 1993, 53: 3186-3192.

4Preston GA, Lang JE, Maronpot RR, et al. Regulation of apoptosis by low serum in cell of different stages of neoplastic progression. Cancer Res, 1994, 54:4214.

5Johnston JB, Lee K, Verburg L, et al. Induction of apoptosis in cD4+prolymphocytic leukemia by deoxyadenosine and 2'-deoxycoformycin. Leukemia res, 1992, 16: 781-788.

6Matsubara K, Kubota M, Adachi S, et al. Induction of apoptosis by low serum in cell of different stages of neoplastic progression. Eur J Haematol, 1994, 52:47-52.

(收稿：1997-10-24修回：1997-12-15)