【摘要】目的研究鼠大脑室管膜下区细胞（SEC）放射性损伤的剂量效应关系及其相关基因表达规律。方法采用10MeV电子线照射昆明鼠全脑制作SEC放射损伤模型,以昆明鼠大脑SEC数、凋亡率和p53，C-jun，C-fos基因表达率为研究指标。结果①照射后6h昆明鼠的SEC数开始下降,24，48h达最低值,120h有所恢复;照射剂量越高,SEC数越少; ②照射后6hSEC出现凋亡，24h凋亡率达到高峰(5,10,20Gy组分别为33.2%,33.3%,37.0%)，120h恢复; ③照射后2hSEC的C-fos表达率达高峰,6h明显下降,24h恢复; ④照射后2hC-jun表达率开始上升,6h达高峰(5,10,20Gy照射组分别为14.1%,23.3%和46.5%),48h下降,120h恢复;⑤照射后2hp53表达率明显上升，24h达到高峰(5,10,20Gy组分别为26.5%,40.8%和66.5%)，48h下降,120h基本恢复。结论放射线诱导SEC的p53，C-jun基因过表达和凋亡是放射性脑损伤的重要发病机制。

Radiation damage and correlative gene expression of subependymal cell of Kunming mouse model

ZHU GuangyingLIANG KeWANG Deguanget al

Department of Radiation Oncology, Cancer Institute, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221001,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the correlation between radiation damage and correlative gene expression of subependymal cell(SEC) of the Kunming mice brain after irradiation.MethodsWhole brain of the Kunming mice was irradiated with 10MeV electron beams to establish the SEC damage model. The cellularity, apoptotic index and expression rate of p53,C-jun and C-fos of SEC of the mice after irradiation were counted.Results①The cellularity of SEC began to decrease 6 hour after irradiation, reached its minimum at 24 or 48 hour , began to recover at 120 hour. The decrement of cellularity of SEC had a dose effect relationship. ②the apoptotic index of SEC began to rise 6 hour after irradiation,reached peak at 24 hour, and recovered at 120 hour.The maximum of apoptotic indexes after irradiation with 5Gy,10Gy and 20Gy were 33.2%,33.3%,37.0%(p＞0.05) respectively. ③The expression rate of C-fos reached its maximum 2 hour after irradiation,decreased apparently at 6 hour , recovered at 24 hour.④ The expression rate of C-jun began to rise 2 hour after irradiation, reached peak at 6 hour, decreased at 48 hour and recovered at 120 hour. ⑤The expression rate of p53 rose apparently 2 hour after irradiation, reached peak at 24 hour , decreased at 48 hour and recovered at 120 hour. The dynamic changing of p53,C-jun expression was similar to that of the decrement of cellularity of SEC.ConclusionInduction of the expression of p53,C-jun, apoptosis and decrement of cellularity of SEC are important in the pathogenesis of brain damage caused by irradiation.

【Key words】Brain; Radiation injury; Gene expression; Cell apoptosis

放射性脑损伤是限制脑部放射治疗剂量、降低疗效的重要因素, 而室管膜下区细胞（subependymal cell, SEC）的放射损伤是放射性脑损伤的重要发病原理^［1］。作者研究了SEC放射损伤相关基因表达及其与凋亡关系,旨在深入了解放射性脑损伤的发病机制,并为今后利用基因、凋亡调控手段防治放射性脑损伤打下基础。

1材料与方法

1.1动物与分组：将100只清洁级雌性昆明鼠（由中国医学科学院肿瘤医院动物室提供,体重14～16g,鼠龄为4～6周）随机分为20，10，5Gy组、空白对照组，每时间点3～5只鼠。

1.2照射方法与剂量：照射前采用硫喷妥钠(质量浓度为20g/L)麻醉,照射时置于自行制作的塑料托盘上,上面覆以厚约5mm的凡士林袋, 采用飞利浦直线加速器、10MeV电子线照射(源皮距100cm,20cm×20cm限光筒,专用铅模)剂量率2Gy/min,照射前实测确定剂量。

1.3取鼠脑实验步骤: 参照姜玉武等^［2］的方法,每时间点取3只昆明鼠，麻醉后固定成仰卧位,开胸穿刺左心室(同时剪破右心房),快速滴注生理盐水(室温)150mL,慢速滴注4℃40g/L多聚甲醛(0.1mol/L磷酸缓冲液配制)100mL,然后开颅取出全脑,置于10%甲醛液中,固定备用。

1.4SEC计数和凋亡细胞计数：将固定标本石蜡包埋后自视交叉嘴侧向尾侧连续切片（片厚6μm,总片数150张）保证室管膜下区在切片范围内；全部切片分组置于载玻片,于60℃烤箱中过夜,常规HE染色,显微镜下选出胼胝体嘴、前联合前及两者的中平面各1张,然后计数每个切片全部SEC。 TUNEL末端标计法检测凋亡细胞试剂盒购自保灵曼公司,严格按说明书操作。参照Shinohara等^［3］的方法,凋亡细胞判定标准为: 细胞出现核固缩、核碎裂和（或）TUNEL染色阳性细胞。

1.5p53，C-jun，C-fos免疫组织化学染色：参照姜玉武等^［2］的方法,一抗的稀释倍数均为1:200,每张切片阳性细胞计数均经两个人观察,结果取平均值；表达率为SEC阳性细胞数/SEC总细胞数。

1.6统计方法 应用EXCEL软件对实验结果进行χ²检验、F分析^［4］。

2结果

2.1常规病理观察：病理形态观察发现20Gy照射后3h昆明鼠SEC形态、分布无明显变化,照射后6h可见少量核碎裂细胞,照射后24h细胞数量明显减少,部分细胞核明显固缩,并见核碎片,呈典型凋亡细胞(图1)。10，5Gy组仍可看到典型的凋亡细胞,但细胞数量下降的程度不如20Gy组。

图110MeV电子照射后24h，典型凋亡细胞（HE染色×100）

2.2SEC计数：照射后2，6，24，48，120h各剂量组昆明鼠SEC计数见图2。照射后24h20，10y，5Gy组、对照组的SEC数分别为216.3±34.4，301.0±12.4，361.3±29.0，461.00±78.9,经统计学处理各组之间差异均有显著性 (P＜0.01)；照射后120h各剂量组SEC数有所恢复。

图2不同剂量照射后室管膜下区细胞数随时间变化情况

2.3照射后昆明鼠SEC凋亡率：照射后各剂量组昆明鼠SEC凋亡率见图3。照射后24h各组凋亡率达高峰,虽然凋亡率有随剂量增加而升高的趋势,但经统计学处理各组间差异无显著性 (P＞0.05)。

图3不同剂量照射后室管膜下区细胞凋亡率随时间变化情况

2.4小鼠SEC的C-fos阳性率：照射后2h各剂量组SEC的C-fos表达率均达峰值,20，10，5Gy组分别为30.5%，21.3%和12.0%；6h已有明显下降,24h恢复到对照组水平(见图4)。

图4不同剂量照射后室管膜下区细胞FC-fos阳性率随时间变化情况

2.5小鼠SEC的C-jun阳性率：照射后2hC-jun表达率开始上升,6h达高峰, 5，10，20Gy组分别为14.1%，23.3%和46.5%；48h下降,120h恢复到对照水平(见图5)。

图5不同剂量照射后室管膜下区细胞C-jun阳性率随时间变化情况

2.6小鼠SEC的p53表达率：照射后2h各剂量组SEC的p53表达率明显上升，24h达到高峰，5，10，20Gy组分别为26.5%，40.8%和66.5%；48h下降,120h基本恢复到对照水平(见图6)。

图6不同剂量照射后室管膜下区细胞p53阳性率随时间变化情况

值得注意的是,SEC的p53阳性率达到高峰的时间与细胞数下降至最低值的时间基本一致。

3讨论

目前认为放射性脑损伤的发病机制与血管内皮细胞损伤和胶质细胞损伤有关，室管膜下区的细胞发育成熟之后可迁徙至大脑半球的深部并演变成为胶质细胞，维持正常髓鞘的形态与功能^［5］。如果SEC受到损伤，大脑半球的深部的胶质细胞得不到补充则可导致脱髓鞘、坏死^［6］。凋亡是一种与许多疾病有关的主动性死亡, 诱导凋亡也是放射线治疗肿瘤