摘要目的：为鉴定已构建的重组hIL-2腺病毒（AdvIL-2）活性，在体外转导人多种癌细胞系，以及观察重组病毒对小鼠腹水癌的治疗作用。方法： 通过ELISA法测定所表达hIL-2 的量，MTT法测定所表达IL-2的活性。从注射后24 h后，每日称量试验小鼠的体重，并观察小鼠的存活情况。结果： 发现AdvIL-2在体外能高效转导多种癌细胞，并检测到有10 ng水平hIL-2表达，持续时间为3周左右。腹腔注射治疗小鼠腹水癌（Math A），总剂量为5×10⁸ PFU，注射AdvIL-2组小鼠腹水增加明显低于对照组：重组荧光酶腺病毒（AdvLuc）、培养基，在观察结束时，试验小鼠的平均体重分别为：26.5 g，39 g和36.5 g。在注射后第30天时观察存活率，AdvIL-2注射组存活率达62.5%，而AdvLuc对照组在30 d时存活率仅为25%，培养基注射组动物则在第25天时全部死亡。结论： 表明AdvIL-2用于腹水癌的治疗效果良好，具有较好前景。

《中国图书资料分类法》分类号R730.5

The Therapeutic Effects of Recombinant hIL-2 Adenovirus on Ascites Tumors

Wei Haiyan， Zheng Changwen， Tong Jing， Sun Xueqi, Peng Xudong

(Technology Center of Sichuan Hoist Group，Chengdu 610075)

AbstractObjective: To identify the activity of recombinant hIL-2 adenovirus(AdvIL-2)， a wide variety of human tumor cell lines were transduced in vitro, and mice with ascites tumors mouse were treated with AdvIL-2.Methods: Expressed IL-2 can be measured by ELISA. The activity of expressed IL-2 was tested with MTT method. The mice were weighted everyday, and the living situation was observed.Results: AdvIL-2 can transduce a wide variety of human tumor cell line in vitro efficiently. As hight as 10 ng hIL-2 was expressed, and the expression can last 3 weeks or so. 5×10⁸ PFU AdvIL-2 was injected i.p. to ascites mice. At the end of therapy, the average weight of AdvIL-2 injected group was lower than the AdvLuc and medium injected groups. The bodyweight were 26.5 g, 39, 36.5 g respectively. The survival rate ascites of treat group is 62.5% at 30th day, while the control group (AdvLuc injected) is 25%. Mice in medium injected group all died at 25th day. Conclusion: AdvIL-2 is effective in cancer therapy.

Key words AdvIL-2； IL-2； Math A

人白细胞介素2（IL-2）为广泛用于临床治疗的细胞因子，由于它能激活多种淋巴细胞，因此主要用于癌症的治疗。而利用AdvIL-2（重组人白介素2腺病毒）进行癌症基因治疗的报道不多。法国的Transgene公司开发的AdvIL-2 治疗胃肠道癌和肺癌，现已处于Ⅰ期临床阶段。国内第二军医大学免疫学教研室的曹雪涛，构建了AdvIL-2，体外转导人肿瘤细胞能检测到每24 h 400～2 600 U/10⁶细胞的表达活性^［1］。Cordier L.报道瘤内注射AdvIL-2小鼠肥大细胞癌，检测到每24 h 200 pg/10⁶细胞^［2］。Toloza体外转导小鼠纤维肉瘤细胞时，IL-2表达量与MOI（感染倍数）有线性关系，MOI=100～1 000时，IL-2表达量为每24 h 10～100 ng/10⁶细胞^［3］。临床及临床前实验表明，持续1周ng级的IL-2足以产生免疫调节效应^［3］。本文目的在于观察所构建的AdvIL-2在多种人癌细胞中IL-2表达产量及表达周期，以及对腹水癌的治疗作用。

1材料与方法

1.1AdvIL-2来源

AdvIL-2由本室构建，并已申请了国家发明专利。

1.2AdvIL-2和AdvLuc扩增及纯化

AdvIL-2和AdvLuc扩增是在293细胞中，待大部分细胞表现出病变效应(CPE)后，收获细胞，超声波破碎细胞以释放病毒，细胞裂解液经高速离心澄清后，经2次CsCl超离心得到纯化病毒，第1次离心条件是，36 000 r/min(SW41 rotor)、离心时间为1 h，梯度组成为1.25 g/ml CsCl和1.40 g/ml CsCl，第2次离心条件是:36 000 r/min(SW41 rotor)、离心时间为18 h，将第1次离心抽取的病毒带与1.33 g/ml CsCl混合后离心，所得到的纯病毒纯度达95%以上，滴度为10¹¹ pfu/ml。

1.3AdvIL-2滴度测定^［4］

采用CPE法。

1.4动物及细胞系

成年BALB/c小鼠，体重约15 g，由成都中医药大学动物实验中心提供。人肺癌细胞（A549），人结肠癌细胞（SW480），人宫颈癌细胞（HeLa），鼠腹水癌细胞（Math A）,CTLL-2细胞购于中国典型培养物保藏中心，由本实验室维持传代。

1.5体外转导细胞^［5］

在细胞培养板中，以MOI=100加入AdvIL-2于单层细胞上，37℃下感染2 h，加入3倍体积的培养液继续培养，24 h后，以无血清的DMEM清洗两次，换新鲜培养基常规培养。以台盼蓝染色确定细胞存活率。对于悬浮长的Math A细胞，离心收集后，以1×10⁶/ml悬浮于感染培养基中，同上加入病毒液，清洗及悬浮于新鲜培养基培养。

1.6IL-2 ELISA测定

由AdvIL-2转导癌细胞表达产生的IL-2利用ELISA法测定。IL-2的ELISA测定方法参照R＆D system公司的IL-2 Quantikine Assay试剂盒说明书。采用双抗夹心法。

1.7IL-2生物活性测定^［6］

IL-2活性检测采用IL-2依赖的CTLL-2细胞作为靶细胞的MTT法。

1.8小鼠Math A转导模型

BALB/c小鼠分为3组，每组8只，每只腹腔注射1×10⁶ Math A细胞，在接种癌细胞后第3天，分别对每组小鼠注射5×10⁸ pfu AdvIL-2 100 μl；5×10⁸ pfu AdvLuc 100 μl；100 μl培养基，从注射24 h起每日称量体重，并观察肿瘤发展及小鼠存活情况。

2结果

2.1AdvIL-2构建

首先将真核表达质粒CMV-mcs-polyA序列插入含有部分野生型腺病毒基因质粒的位点,再利用BamHⅠ将hIL-2 cDNA插入到穿梭质粒pAC-CMV puc18多克隆位点，得到重组hIL-2的表达载体。通过重组hIL-2的表达载体与超过包装限制的，含有全部野生型腺病毒基因质粒之间的同源重组，利用PCR法筛选产生的重组病毒，通过空斑法纯化重组病毒。

2.2AdvIL-2表达动力学

以AdvIL-2（MOI=100）感染2 h后，测定不同天数转导细胞分泌的IL-2。转导细胞分泌的IL-2均在ng级，达到治疗用量（图1）。IL-2的表达主要集中在5～10 d，在此期间多数细胞的表达产量在10 ng/ml左右。IL-2的表达最长可维持3周左右。实验结果表明，AdvIL-2能够在体外高效转导多种癌细胞并高水平表达IL-2。

图1AdvIL-2 体外表达动力学

Fig.1AdvIL-2 expression dynamics in vitro

2.3IL-2生物学活性测定

利用IL-2依赖性的CTLL-2增殖实验测定经AdvIL-2转导后各种癌细胞所释放的IL-2，均具有生物学活性（图2）。转导细胞产生的IL-2活性大小与ELISA法测定的IL-2产量基本成正比，约为0.2 IU/pg。在5～10 d达到表达高峰期，IL-2平均产量约为2 000 IU/ml。

图2转导肿瘤细胞表达的hIL-2活性

Fig.2The bioactivity of the hIL-2 produced

by transduced cell in vitro

2.4对小鼠腹水癌的治疗作用

通过腹腔注射AdvIL-2观察AdvIL-2对小鼠腹水癌的治疗作用(图3)。注射AdvLuc和培养基小鼠在30天中的生长期平均体重增长明显大于 AdvIL-2 注射小鼠（分别从相同起始体重7.5 g增至 39 g，36.2g和 26.5g）。在30天的生长期中，注射培养基的小鼠于第25天全部死亡，注射AdvIL-2的小鼠在第30天时仍有5只存活。对所有小鼠荷瘤状况分析发现，所有注射AdvLuc和培养基的小鼠均长出腹水型肿瘤（以小鼠腹部明显增大并可抽出乳白色腹水为准）。而AdvIL-2 注射小鼠只有2只出现肿瘤（其中1只于30天死亡）。

图3经腹腔注射AdvIL-2后小鼠的抑瘤率和延命率情况

Fig.3 The effect on mouse ascites by i.p. injection of AdvIL-2

A: The development of tumor in each group；

B: The surv