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《中国图书资料分类法》分类号R735.7-36
Liposome-Mediated Murine Endostatin Gene Therapy for Human Hepatoma
Tang Yucheng， Ju Zhonghua, Qian Guanxiang， Chen Shishu
(Research Center for Human Gene Therapy, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025)
AbstractObjective： To demonstrate that liposome-mediated endostatin gene therapy is a viable approach for cancer antiangigensis therapy. Methods： Mouse endostatin cDNA was amplified from the murine liver by means of RT-PCR. After being verified by sequence, secreted expression vector pSEC-endo was constructed. The biological activity of the expressed endostatin was demonstrated by inhibition of proliferation of endothelial cells in response to stimulation by bFGF. The mechanism of this effect was studied by means of TDT dUTP nick-end-labeling assay and agarose electrophresis. By injection of liposomes complexed to murine endostatin cDNA, the inhibition of the growth of SMMC-7721 that implanted in nude mice was tested. Results： The sequence of mouse endostatin cDNA is identical with data reported from Olsen. The expressed endostatin could specifically inhibit the proliferation of endothelial cells in response to stimulation by basic fibroblast growth factor. The mechanism of this effect seems to be related with apoptosis. In addition, the efficacy of the endostatin vector treatment in reducing the volume of tumors implanted in nude mouse model was significant. Conclusion： These findings provide a basis for the further development of gene therapy with endostatin as an antiangiogenic gene.
Key words mouse endostatin； anti-tumor; hepatoma
实体瘤生长超过几个立方亳米后就需要新生血管形成以支持其继续生长［1］，许多研究表明原发性肿瘤和转移性肿瘤生长依赖于新生血管的生成［2～4］。endostatin是从鼠血管内皮瘤细胞株中克隆出来的血管生成抑制剂。它是胶原ⅩⅧ的羧基未端酶解产物，人鼠内皮细胞抑制素同源性很高，能特异性抑制内皮细胞增殖和新生血管生成。在荷瘤小鼠系统给予从E.coli菌珠中纯化的内皮细胞抑制素 蛋白能有效地抑制Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、B16黑色素瘤和鼠血管内皮瘤的生长，而且在这些肿瘤动物模型中末观察到有耐药性现象的发生。另外反复给予内皮细胞抑制素 能使肿瘤处于休止状态，其机制尚末阐明［5］。
为解决体外重组蛋白分离纯化的复杂性及更有效地使内皮细胞抑制素在肿瘤局部达到有效作用浓度，采用RT-PCR的方法从鼠肝中克隆出了鼠内皮细胞抑制素cDNA，经测序证实后，构建能在哺乳动物细胞中分泌表达鼠内皮细胞抑制素的分泌表达载体pSEC-endo，同时在动物模型中进行了阳离子脂质体介导的分泌表达载体pSEC-endo抗肿瘤研究，为日后其在基因治疗中的应用打下了基础。
1材料与方法
1.1主要试剂
质粒pSEC-hygromycin购自INVOTROGEN公司。puc-T载体购自上海生工生物工程有限公司。各种限制性内切酶，T4DNA连接酶，M-MLV逆转录酶为GIBCO BRL公司产品。QIAEXII凝胶回收试剂盒为QIAGEN公司产品。DEAE-葡聚糖试剂购自大连宝生物工程有限公司。细胞原位凋亡检测试剂盒为BOEHRINGER MANNHEIM公司产品。兔抗鼠内皮细胞抑制素多克隆抗体为德国Max-Planck Institute Rupert Timpl 教授惠赠。
1.2动物及细胞株
COS-7细胞为本室传代保存。SMMC-7721细胞为第二军医大学提供。裸小鼠，6～8周龄，雄性，购于中科院上海实验动物中心。
1.3鼠肝总RNA的提取及RT-PCR
按鼠的cDNA序列设计合成引物：5′端引物为5′-GGCTATTTGGAGAAAGAGGTCATGAAGC-3′;3′端引物为5′-ATGAACGGACATACTCATCAGGACTTTCAGC-3′;逆转录反应按M-MLV逆转录试剂盒上方法进行。PCR反应条件参照文献［2］进行。
1.4表达载体的构建
利用BamHⅠ，NotⅠ双酶切电泳回收550 bp的Endostatin小片段，分泌表达载体pSEC-hygromycin 经同样双酶切后，连接、转化感受态细菌DH-5α，酶切鉴定筛选获得阳性克隆。
1.5COS-7细胞短暂表达endostatin
利用DEAE-葡聚糖转染COS-7细胞高水平、短时期表达所需蛋白质，收获上清，室温下以约1 000 g离心10 min，除去死细胞和碎片，经浓缩后，保留备用。
1.6表达产物的各项性质测定
1.6.1RT-PCR
提取转染空白载体pSEC和阳性质粒pSEC-endo的COS-7细胞总RNA，按前述方法进行RT-PCR反应。
1.6.2Western blot
取COS-7细胞的分泌上清浓缩后，行PAGE电泳，用电转移装置将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维膜上，封闭液处理后，加入兔抗鼠多抗温育，PBS漂洗后, 加入山羊抗兔碱性磷酸酶标记的二抗，室温温育，充分洗膜后，加入BCIP/NBT显色，用含EDTA的PBS终止反应，拍照记录结果。
1.7内皮细胞增殖分析
将牛主动脉内皮细胞消化后，用含2%新生牛血清的DMEM培养基洗2次，调整细胞计数为1×105/ml，接种于96 孔培养板中，每孔50 μl，37℃培养24 h后，换用含3 ng/ml bFGF 和 浓缩后含鼠内皮细胞抑制素的分泌上清的新鲜DMEM培养基共培养24 h 后，进行MTT 比色法检测。
1.8凋亡的研究
1.8.1TUNEL分析
同上处理的牛主动脉内皮细胞用4%多聚甲醛固定液固定25 min，TUNEL分析参见宝灵曼公司产品说明进行。
1.8.2琼脂糖凝胶电泳
收集同上处理的内皮细胞用4 ml的PBS重悬洗后，按常规制备DNA，用1.5%琼脂糖电泳观察。阳性对照组为TNF，并设不相关对照，细胞选用NIH3T3,SMMC-7721。
1.8.3人肝癌动物模型
1．8．3．1收集处于对数生长期的SMMC-7721，接种瘤细胞剂量为5×105，隔天观察，待肿瘤结节为2～3 mm大小时，随机分为3组，每组4只动物，对照组为生理盐水组，及DOSPER介导空白质粒pSEC组，治疗组为DOSPER质粒pSEC-endo混合组，两者比例为2∶1，分别溶于HBS溶液，混合后室温下静置30 min，待DOSPER质粒混合物形成后，瘤内注射。每3 d瘤内注射1次，剂量为每次20 μg，持续12 d，并用卡尺测量1次肿瘤大小，肿瘤体积以公式1/2 ab2计算，a为长径，b为肿瘤短径，单位为毫米（mm）。
1．8．3．2鼠内皮细胞抑制素瘤内蛋白表达的免疫组织化学染色，以上各组肿瘤行冰冻切片，以胞浆有棕色颗粒为阳性细胞。
1．8．3．3肿瘤中微血管密度检测，同上各组肿瘤行冰冻切片后，以兔抗Von Willebrand 因子多抗为一抗，免疫组化染色后，光学显微镜下观察，任何一个棕色内皮细胞作为一个血管，每个标本选取5个视野，计算机处理系统测定单位视野（315699.8 μm2）下棕色面积，计算微血管密度（单位视野棕色面积/单位视野面积）。
1.9统计学方法
多样本均数比较采用方差分析。
2结果
2.1鼠内皮细胞抑制素的克隆及序列分析
提取鼠肝总RNA，RT-PCR扩增出鼠endostatin cDNA,PCR产物进行琼脂糖电泳结果显示片段大小为554 bp左右与预期大小一致，如图1所示。PCR产物经QIAEXII凝胶回收纯化片段，将endostatin cDNA克隆至puc-T载体, 测序结果表明与文献报道一致。
