摘要目的： 研究冻融的肿瘤抗原冲击致敏的骨髓来源的树突状细胞(DC)对结肠癌小鼠是否具有治疗作用。方法： 用小鼠结肠癌细胞株C26冻融抗原体外冲击致敏BALB/c小鼠骨髓来源的DC，观察其体外刺激荷瘤小鼠脾细胞增殖的能力及其诱导的CTL对C26肿瘤细胞的杀伤活性；体内以3×10⁵ DC /只一次或多次接种于已荷瘤10 d结肠癌的小鼠同侧腹股沟皮下，观察抗原冲击的DC对肿瘤生长的抑制作用以及对荷瘤小鼠生存期的影响。结果： 体外抗原冲击致敏的DC能显著刺激荷瘤小鼠脾脏T细胞增殖，其诱导的CTL对C26肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，在效靶比为10∶1，5∶1，2.5∶1时其杀伤率分别88.1%，71.4%和50.0%；抗原冲击致敏的DC体内多次皮下免疫后对肿瘤的生长具有显著的抑制作用，能显著延长荷瘤小鼠的生存期。一次性DC体内免疫接种对荷瘤小鼠的治疗作用不明显。结论： 肿瘤细胞冻融抗原体外冲击致敏的DC多次皮下免疫对结肠癌小鼠具有显著的治疗效果。

《中国图书资料分类法》分类号R730.50

Treatment of Established Colon Carcinoma-Bearing Mice by Vaccination with Dendritic Cells Pulsed with Tumor Cell Lysates

Tang Hua, Yin Pingzhang, Kong Lingfei, Cao Xuetao

(Cancer Biotherapy Center of Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003)

AbstractObjective： To investigate whether vaccination with dendritic cells pulsed with C26 colon carcinoma cell lysates has the therapeutic effect on the established C26 colon carcinoma-bearing mice.Methods： Dendritic cells generated from murine bone marrow were pulsed with C26 tumor lysates. The T cell stimulating activity and CTL induction were detected. The dendritic cells were injected s.c (3 ×10⁵/muose) only once on the day 10 or 4 times on the day 10, 15, 20, 29 repeatedly after the C26 tumor cells were inoculated. The therapeutic effect of DC was observed.Results： DC could stimulate proliferation of syngeneic T cells potently, and induce CTL activity markedly. The tumor growth was significantly suppressed and the survival time of tumor-bearing mice was prolonged when the DC pulsed with tumor lysates were injected s.c repeatedly.Conclusion: Vaccination with DC pulsed with tumor lysates has the potent therapeatic effect on the established colon carcinoma-bearing mice.

Key words dendritic cell； immunotherapy； colon carcinoma； tumorlysate； cytotoxic T lymphocyte

树突状细胞（dendritic cells, DC）是机体功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，也是唯一能激活初始型T细胞(naive T cell)的APC，处于免疫反应的中心地位。DC有摄取抗原的能力，具有从外周向淋巴器官迁移的特性，成熟的DC高表达MHCⅠ，Ⅱ类分子、共刺激分子和其他粘附分子，最后定位于次级淋巴器官的T细胞依赖区启动特异性免疫反应^［1］。DC在机体内含量极少，但自从1992年Inaba^［2］建立了从小鼠骨髓诱导扩增大量DC的方法以后，DC的研究日渐深入，人们已经开始将其应用于恶性肿瘤的免疫治疗。在以前的工作中，我们证明肿瘤抗原冲击致敏的（pulsed）DC免疫过的小鼠具有抵抗致死剂量的肿瘤细胞再攻击的能力^［3］。在本研究中，我们用小鼠结肠癌细胞株C26作为模型，试图探讨C26肿瘤细胞冻融抗原(lysate)体外冲击致敏的DC对已经荷瘤小鼠的治疗作用。

1材料与方法

1．1实验动物与细胞株

BALB/c(H-2^d)小鼠，6～8周龄，雌性，购自河南医科大学实验动物中心。小鼠结肠癌细胞株C26(H-2^d)和小鼠肾癌细胞株Renca(H-2^d)，从第二军医大学免疫学教研室引进，于本室常规传代培养。

1.2主要试剂及仪器

重组小鼠GM-CSF、 重组小鼠IL-4、MTT均购自Sigma公司。［³H］-TdR购自中国原子能研究院。RPMI 1640培养基购自GIBCO。DG3022A型酶联免疫检测仪，为国营华东电子管厂生产。

1.3骨髓树突状细胞的培养

参照Inaba^［2］的方法稍加修改。无菌取小鼠后肢股骨的骨髓细胞，用Tris-NH₄Cl溶去红细胞后，PBS洗2次，用含mGM-CSF(3.3 ng/ml)、mIL-4(1 ng/ml)和10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬至1.0×10⁶/ml，铺于24孔培养板上，1 ml/孔，于37℃， 5%CO₂培养箱中培养，第3天轻轻晃动培养板，吸弃全部上清，及时补入含细胞因子浓度相同的完全培养基，第6天轻轻吹吸下疏松粘附于培养板底的聚集体，置于培养瓶中并加入等量的上述完全培养基，继续培养24 h。

1.4C26肿瘤细胞冻融抗原的制备

收集处于对数生长期的C26肿瘤细胞，洗2次，用RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2×10⁷/ml，反复冻融(-20℃/37℃)4次，4 500 r/min离心1 h，吸上清，过滤除菌。

1.5C26冻融抗原对DC的体外冲击致敏

第7天收集上述DC，以DC与抗原的比例1∶10(抗原的量以冻融前肿瘤细胞的量计)加入C26肿瘤冻融抗原，DC的终浓度为2×10⁶/ml，于6孔培养板中继续培养16 h，第8天收集，并补入含细胞因子的完全培养基及肿瘤冻融抗原，使细胞浓度为1×10⁶/ml，DC与抗原的比例为1∶20，继续培养4～6 h。收集备用。

1.6C26冻融抗原冲击致敏的DC的抗原提呈能力

无菌取已经荷瘤1周或未荷瘤的小鼠脾脏，于200目钢网上，研磨至单细胞，溶去红细胞，洗2次，用RPMI 1640重悬，注入尼龙毛柱，置37℃孵育1 h，预热RPMI 1640冲出非粘附细胞，收集，作为T细胞即反应细胞。该细胞与上述抗原冲击致敏的DC或未冲击致敏的DC (经25 μg/ml的丝裂霉素C 37℃45 min灭活)一起铺于96孔培养板上，各100 μl/孔，使DC与反应细胞的比例分别为1∶100，1∶330，1∶1 000，置于37℃,5%CO₂培养3 d。于培养结束前16 h加入［³H］-TdR(37 kBq/孔)，常规收集细胞，置液闪仪上检测，计算cpm值。

1.7CTL的体外诱导

无菌取上述荷瘤1周小鼠脾脏的T细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640重悬，与上述抗原冲击致敏的DC以500∶1的比例一起混合，并加入IL-2 10 U/ml，置于5％CO₂，37℃中培养7 d，于第7天收集活细胞作为效应细胞，备用。

1.8用MTT法检测CTL杀伤活性

参照Hussain^［4］的方法稍加修改，收集处于对数生长期的C26或Renca肿瘤细胞作为靶细胞，以效靶比分别为10∶1，5∶1，2.5∶1比例置于96孔平底培养板上，于37℃作用4 h后，加入MTT 20 μl(终浓度0.5 mg/ml)，37℃孵育3 h后，轻轻吸弃100 μl上清，补入100 μl 10%SDS，37℃孵育2 h，用酶联免疫检测仪检测OD值，以下述公式计算杀伤效率。

1.9C26冻融抗原冲击致敏的DC对肿瘤生长的抑制作用

每组7只小鼠，皆于右后肢股外侧皮下接种处于对数生长期的C26细胞(1.5×10⁵/只)。分别在肿瘤细胞接种后一次(第10天)或多次(第10，15，20，29天) 于同侧腹股沟皮下接种C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC(3×10⁵/只/次)。于肿瘤可触及后，每天测量肿瘤的纵径和横径，用公式1/6 πab²计算肿瘤体积，其中a表示纵径，b表示横径。

1.10C26冻融抗原冲击致敏的DC对荷瘤小鼠生存期的影响

观察荷瘤小鼠的生存期和存活率，以肿瘤的体积大于10 cm³或肿瘤出现溃疡为小鼠死亡。

2结果

2.1DC的抗原提呈功能

倒置显微镜下观察发现，C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC能与荷瘤小鼠T细胞形成特征性的聚集体，而且随着培养时间的延长，大而圆的细胞会逐渐从聚集体上释放出来（可能是被激活的T细胞）；而抗原冲击致敏的DC和正常鼠T细胞以及未用肿瘤抗原冲击致敏的DC与荷瘤鼠T细胞的培养体系中都没有上述现象出现。进一步用［³H］-TdR掺入法检测发现，各种梯度的冻融抗原冲击致敏的DC皆可刺激荷瘤鼠脾T细胞显著增殖（图1）。

2.2DC诱导的CTL杀伤活性

C26肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏的DC可诱导产生杀伤活性较强的CTL，在效靶比为10∶1，5∶1和2.5∶1时，杀伤率分别为88.1%，71.4%和50.0%，而此CTL对Renca肿瘤细胞没有杀伤作用，说明抗原冲击致敏的DC诱导的CTL具有抗原特异性。

2.3DC免疫对肿瘤生长的抑制作用