摘要目的: 本文对超抗原葡萄球菌肠毒素B（SEB）活化的 Th1细胞介导的对肿瘤细胞杀伤作用进行了研究。方法: 人外周血淋巴细胞与SEB共同培养，用流式细胞术测定增殖细胞亚群；用酶联双夹心法测定IL-2，IL-4水平；用K562，HL-60肿瘤细胞和自身淋巴细胞作为靶细胞测定效应细胞和细胞因子的杀伤活性。结果: SEB共同培养6 d的淋巴细胞，CD4⁺T细胞由37.5%增加到48.5%； CD16⁺淋巴细胞由14.3%增加到27.9%；CD8⁺T细胞无明显增加。预先去除CD8⁺T细胞不影响SEB对 CD4⁺T细胞的活化作用。结论: SEB活化CD4⁺T细胞是Th1而不是Th2细胞。它们释放大量的IL-2而不是IL-4。活化的Th1细胞介导了效应细胞和细胞因子对肿瘤细胞的非特异性杀伤效应，但是不能介导CTL的杀伤作用。

《中国图书资料分类法》分类号R371.2

Superantigen Activated Th1 Cell Mediated Mechanisms to Kill Tumor Cell Lines

Chen Yu, Li Lin, Yu Chengze, Zhou Yanheng

(Department of Immunology,PLA General Hospital, Beijin 100853)

AbstractObjective: We studied the cytotoxic effect of CD4⁺ Th1 cell mediated against tumor cell lines.Methods: Human peripheral lymphocytes were incubated with Staphylococcal enterotoxin B (SEB) for several days. We measured lymphocyte subsets by flow cytometry, IL-2 and IL-4 lever by ELISA, and cytotoxic activity of NK, cytokines, CTL against K562, HL-60 and isogenous lymphocytes by cell culture.Results: The results showed that CD4⁺ T cells with SEB stimulation increased from 37.5% to 48.5%. CD16⁺ lymphocytes increased from 14.3% to 27.9%(P≤0.05). CD8⁺ T cells were not proliferative. Activated CD4⁺ T cells released high level of IL-2 rather than that of IL-4. NK cells and cytokines showed significant effect of killing tumor cell lines, but CTL was not.Conclusion: The results suggested that CD4⁺ Th1 cells by SEB-activating could mediate NK cells and cytokines to kill tumor cell lines but can not regulate anti-tumor function of CTL.

Key words T cell; superantigen; tumor

细胞介导的细胞毒作用是机体抵御细胞内病原菌感染和肿瘤的重要免疫机制。这一机制通常是由活化的CD8⁺T细胞（CTL）和NK细胞及一些细胞因子来承担^［1］。近年来的研究发现在杀伤肿瘤过程中，缺少CD4⁺T细胞的辅助作用也不能产生有效的抗肿瘤作用，包括NK细胞的活化。例如，日本学者研究表明，当Th1细胞高于70%时，可以维持NK细胞的活性，当低于15%时，NK细胞则难以存活。我们以往的研究发现葡萄球菌肠毒素B（SEB）能诱导Th1细胞大量增殖^［2，3］。本文对活化的CD4⁺T细胞介导的肿瘤杀伤伤机制进行了研究。

1材料与方法

1．1淋巴细胞亚群计数

5×10⁵/ml细胞与100 ng SEB（军事医学科学院五所购入）共同培养0 d和6 d。取培养细胞1×10⁶加20 μl抗CD4-FITC抗体和20 μl抗CD8-抗体双染色。另外加20 μl抗CD16-FITC抗体单染色（抗体由PharMingen公司购入）。流式细胞术计数CD4⁺T，CD8⁺T和CD16⁺淋巴细胞数量。

1.2去除CD8⁺T细胞的淋巴细胞制备

鼠抗人CD8单克隆抗体（军事医学科学院赠送）200 μg/ml×10 ml预先包被玻璃平皿。置室温1～2 h，弃上清，用MEM洗板2次后加入1×10⁷淋巴细胞，室温下反应2 h，获取悬浮细胞。流式细胞术测定记录去除前后CD8⁺T细胞的数量，并计算去除率。细胞去除率=［（去除前-去除后）/去除前］×100%。

1.3去除CD8⁺T细胞后CD4⁺T细胞的增殖

去除CD8⁺T细胞后的淋巴细胞与SEB共同培养，取培养0，10，28 d以上的细胞染色，用FACS测定，记录CD4⁺T和CD8⁺T细胞的数量。

1.4IL-2和IL-4的测定

1×10⁵/ml细胞分别与100 ng SEB共同培养。取培养1～9d的细胞上清，经离心沉淀后，用ELISA双夹心法（美国 R & D公司购入）测定IL-2和IL-4水平^［2］。

1.5NK细胞杀伤率测定

5×10⁵/ml细胞与100 ng SEB共同培养。取0 d和6 d的效应细胞与靶细胞K562（和HL-60）以10∶1比例共同培养5 h。MTT染色，记录490 nm波长下的OD值。计算NK细胞的杀伤率：NK杀伤率=［1-（效应细胞+靶细胞OD-效应细胞OD）/ 靶细胞OD］×100%。

1.6细胞因子杀伤率测定

5×10⁵/ml细胞与SEB共同培养0 d和6 d。取培养上清经离心去沉淀后与靶细胞K562共同培养5 h。MTT染色，记录490 nm OD值，计算杀伤率。细胞因子杀伤率=（1-实验组OD/靶细胞OD）×100%。

1.7CTL杀伤率测定

采用同种异体淋巴细胞杀伤系统，靶细胞和效应细胞均来自于同一个体，称为淋巴细胞1。淋巴细胞2来自另一个体作为刺激原。①靶细胞制备：1×10⁶/ml淋巴细胞1加30 μg PHA共同培养5 d。细胞终浓度调制成1×10⁵/ml待用。②效应细胞制备：淋巴细胞1加丝裂霉素处理后的淋巴细胞2共同培养5 d，作为对照组。实验组效应细胞为淋巴细胞1加丝裂霉素处理的淋巴细胞2再加SEB共同培养5 d。③混合淋巴细胞培养：效应细胞和靶细胞等体积培养4小时（效∶靶=10∶1）。MTT染色记录490 nm OD值。计算CTL杀伤率(%)。CTL杀伤率=［1-（效应细胞+靶细胞-效应细胞OD）/靶细胞OD］×100%。

2结果

2．1SEB诱导CD4⁺T细胞、CD16⁺淋巴细胞的增殖

它们分别由最初的(37.5±4.5)%增加到(48.5±8.7)%; 由(14.3±3.4)%增加到(27.9±31.1)%(P≤0.05)。CD8⁺T细胞未增殖（P≤0.05）。

2．2去除CD8⁺T细胞后CD4⁺T细胞的增殖

用鼠抗人单克隆抗体预先去除CD8⁺T细胞（去除率达92.04%）,不影响SEB诱导CD4⁺T细胞的增殖。与SEB共同培养0，10，28 d以上CD4⁺T细胞数量呈直线上升，达到99.34%。

2．3SEB活化的是Th1而不是Th2细胞

SEB活化CD4⁺T细胞释放高水平IL-2而不是IL-4。100 ng SEB与淋巴细胞共同培养3 d，产生大量的IL-2,而IL-4的释放水平为0。

2．4Th1细胞介导的对肿瘤细胞的杀伤效应

SEB活化的CD4⁺Th1细胞介导了NK 细胞和细胞因子对K562细胞的杀伤活性。其杀伤率分别由最初的(39.8±3.5)%上升到(61.9±4.8)%(P≤0.01)，和由0%增加到(28.5±10.5)%(P≤0.01)。CTL的杀伤活性无明显提高，由(25.8±18.6)%上升到(51.5±21.9)%，无显著性意义(P≥0.05)。

2．5SEB诱导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用是非特异性杀伤，它们对K562细胞和HL-60细胞都显示出明显的杀伤作用。

3讨论

超抗原与普通多肽抗原不同，它们以特殊的方式与T细胞受体的Vβ结合， 从而使大量的 T细胞活化^［4,5］。不同的条件会产生不同的结果，即活化T细胞，释放细胞因子参与抗感染、抗肿瘤作用；诱导免疫耐受和诱导自身免疫应答反应^［6～8］。我们以往的研究用SEB诱导了大量的 CD4⁺Th1细胞的活化。本研究发现这些活化的CD4⁺Th1细胞（而不是SEB 本身）介导了效应细胞和细胞因子的抗肿瘤作用。实验结果显示SEB能诱导CD4⁺T细胞和CD16⁺淋巴细胞增殖。SEB刺激淋巴细胞后的第6天，CD4⁺T细胞由37.5%增加到48.5%，CD16⁺淋巴细胞由14.3%增加到27.9%，CD8⁺T细胞无明显增殖。用酶联方法测定上清液中细胞因子,发现SEB活化的CD4⁺T细胞是Th1细胞而不是Th2细胞,因为它们只分泌IL-2而不分泌IL-4。以K562细胞为靶细胞检查了NK细胞和细胞因子的杀伤活性，发现NK细胞的杀伤能力由最初的38.9%提高到61.9%，细胞因子的杀伤活性由最初的0提高到28.5%，但是CTL的杀伤活性无明显增加。超抗原不能直接活化NK细胞是已知的，因为NK细胞表面缺乏识别超抗原的TcRVβ受体，因此推断NK细胞的肿瘤杀伤活性并不是由SEB直接刺激而产生的。IL-2，IL-12，IFN-α等细胞因子都能使NK细胞活化，引起强烈的杀伤反应^［9,10］。SEB诱导CD16⁺ 淋巴细胞（NK细胞表面标志之一）增加，与活化的Th1细胞大量分泌的IL-2的参与有关，是IL-2调节了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。然而<