摘要目的： 探讨以多药耐药相关蛋白（MRP）作为靶分子进行胃癌多药耐药基因治疗的可行性。方法： 采用已构建成功的mrp反义RNA真核载体pcDNA-Amrp转染胃癌细胞系SGC7901，用G418抗性筛选出稳定细胞克隆，命名为M-SGC7901；用³²P标记的寡核苷酸探针打点杂交检测M-SGC7901细胞中mrp mRNA表达的变化；从细胞生长曲线中，观察M-SGC7901细胞生长速度的变化；经0.005 μg/ml的长春新碱(VCR)处理1月后，行流式细胞术检测M-SGC7901细胞周期的改变；同时，行MTT法检测M-SGC7901对VCR的 IC₅₀值；最后，行Habit法检测M-SGC7901中谷胱苷肽S-转移酶（GST）活性。结果： ① M-SGC7901细胞的mrp mRNA表达的阳性信号明显较对照组弱。② M-SGC7901细胞生长速度与对照组无明显差异(P＞0.05)。③ M-SGC7901生长明显阻滞于S期(P＜0.05)。④ M-SGC7901对VCR的IC₅₀值显著降低(P＜0.05)。⑤ M-SGC7901中GST活性与对照组相比无明显差异(P＞0.05)。结论： 本文为以mrp为靶基因进一步进行胃癌多药耐药基因治疗的研究奠定了一定的实验基础。

《中国图书资料分类法》分类号R735.2

Reversal Effects of mrp Antisense RNA on the Resistance of Gastric Cancer Cell Line SGC7901 to VCR

Yu Zhaocai, Ding Jie， Bi Feng， Han Quanli, Zhang Xueyong, Fan Daiming

(Institute of Digestive Diseases, Xijing Hospital, Xi'an 710032)

AbstractObjective: To evaluate the possibility of gene therapy with MRP as target in multiple drug resistance of gastric cancer. Methods: A mrp antisense eukaryotic vector pcDNA-Amrp prepared in previous study was delivered into the gastric cancer cell line SGC7901, mediated by lipofectamine and then, a stable transfected cell clone resistant to G418 was screened out and named as M-SGC7901. Dotting blot with a specific ³²P labeled oligonucleotide as the probe was conducted to test the expression of mrp mRNA in M-SGC7901.Followingly, cell growth curve was plotted to assess the proliferative speed of M-SGC7901. After one month treatment with VCR(0.005 μg/ml), progression of cell cycle in M-SGC7901 was shown by cytometry. Meanwhile, the IC₅₀ value of M-SGC7901 to VCR was detected by MTT; Finally, GST activities in both M-SGC7901 and controls were also measured by Habit method. Results: ① Positive signal of mrp mRNA expression in M-SGC7901 was shown dramatically weaker than those in controls. ② No marked difference in cell growth was observed between M-SGC7901 and the control groups (P＞0.05). ③ The growth of M-SGC7901 was significantly arrested at the inlet of S phase, as compared with controls (P＜0.05). ④ The IC₅₀ value was found to drop to a point of 3.12×10^-3, as compared with 0.201 and 0.170 respectively in the controls, (P＜0.05). ⑤ No different finding in GST activities, as a result, was obtained between M-SGC7901 and the controls (P＞0.05). Conclusion: Collectively, this study, to some extent, has laid an experimental foundation for further research of gene therapy on the basis of MRP in resistant gastric cancer.

Key words.

Key wordsantisense RNA; multidrug resistance associated protein; gene therapy; gastric cancer

多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein, MRP）是在阿霉素（ADR）耐药的小细胞肺癌细胞系中发现的一种新的与肿瘤耐药相关的蛋白^［1］。①免疫组化发现，在许多耐药的肿瘤组织，呈高表达。将该蛋白的编码子基因转入药物敏感的肿瘤细胞系，可诱发对多种化疗药物的耐受性^［2］；②本所的研究发现,在临床未经化疗的胃癌组织以及胃癌细胞系SGC7901中，MRP分子亦有较高水平的表达，提示在胃癌的原发性耐药中起着重要作用^［3］。不仅如此，其介导的耐药途径与其它分子介导的耐药途径有交叉^［4,5］。本文采用已构建的mrp反义RNA真核载体转染胃癌的细胞系SGC7901，以了解mrp表达的变化对该细胞系长春新碱敏感性的影响，为逆转胃癌耐药开辟新疗法奠定基础。

1材料与方法

1.1细胞转染及稳定克隆的挑选

SGC7901细胞株用含100 ml/L小牛血清的RPMI 1640培养，置37℃，5%CO₂的孵箱中，待其进入对数生长期密度为60%时，用Lipofectamine (GIBCO公司产品)包裹pcDNA-Amrp转染SGC7901, 用G418筛选(浓度400 μg/ml), 每3 d换液1 次，每7 d传代1次，4周后有抗性细胞克隆形成，挑选G418 (GIBCO公司产品)抗性单细胞克隆，命名为M-SGC7901。同时用pcDNA空载体转染SGC7901作为对照细胞，经G418抗性筛选，命名为P-SGC7901。

1．2打点杂交检测转染细胞中mrp RNA表达的变化

参照文献［6］方法进行。M-SGC7901和对照细胞分别各取10 μg 总RNA点膜。从mrp cDNA序列第4 501 bp起正向读取30个bp，并推出其互补DNA序列5′-GGT, CGA, ACA, CAC, GGA, TCG, GGC, CCG, GGA, CGA-3′。合成单链寡苷酸探针，并用［α-³²P］ ATP（北京福瑞公司产品）末端标记。

1．3转染细胞生长速度观察

采用细胞计数检测3种细胞的生长曲线，并按Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间。

1．4转染细胞VCR处理后细胞周期分析

在RPMI 1640细胞培养基中加入VCR至浓度为0.005 μg/ml，培养SGC7901，P-SGC7901和M-SGC7901, 每3 d换液1 次，培养1月(由于用含VCR细胞培养液的培养细胞，转染细胞生长缓慢并有死亡，故需培养1月)。按常规方法进行流式细胞术检测M-SGC7901，P-SGC7901和SGC7901的细胞周期。

1．5转染细胞体外药物敏感实验

采用MTT法。

1．6转染细胞GST活性测

参照Habit方法^［7］。

1．7统计学处理

用Student's t检验作显著性分析。

2结果

2．1转染细胞中mrp mRNA表达的变化

对M-SGC7901，P-SGC7901和SGC7901用³²P ATP标记的mrp单连寡核苷酸探针进行打点杂交，结果显示，M-SGC7901细胞中mrp mRNA阳性信号明显较其他2种对照细胞系弱。说明M-SGC7901细胞中mrp mRNA的表达被显著抑制，如图1所示。

图1比较M-SGC7901，P-SGC7901和

SGC7901中mrp表达的变化

Fig.1The expressing changes of mrp in M-SGC7901，

P-SGC7901 and SGC7901

2．2转染细胞生长曲线的检测

采用细胞计数检测3种细胞的生长曲线，3种细胞的接种数量均为4×10⁴个，从培养第3天至第7天，3种细胞均处于对数生长期，且细胞计数无明显差异，结果提示这3种细胞的生长速度没有显著差异，其细胞倍增时间分别为29 h，24 h和37 h。提示单独抑制mrp mRNA表达对细胞生长速度无明显影响。

2．3细胞药物敏感性的检测

采用MTT法检测M-SGC7901，P-SGC7901和SGC7901对VCR的存活率, 结果如图2所示，IC₅₀值分别为3.12×10^-3，0.170和0.201，具有显著差异。说明M-SGC7901对VCR的敏感性显著增加。

图2M-SGC7901，P-SGC7901和SGC7901

对VCR的剂量-生存率曲线

Fig.2Effect of VCR on M-SGC7901,P-SGC7901

and SGC7901 cells by MTT

2．4VCR 对转染细胞细胞周期的影响

用流式细胞仪检测M-SGC7901，P-SGC7901和SGC7901的细胞周期，如表1所示，M-SGC7901细胞经VCR处理后其生长明显阻滞于S期。

2．5谷胱苷肽S-转移酶（GST）活性的检测

用Habit法检测M-SGC7901，P-SGC7901和SGC7901中GST活性，结果分别为1.026，0.872和0.986 U·min^-1.mg^-1。3种细胞内GST活性值无显著差异(P＞0.05)，说明抑制mrp mRNA的表达对GST的活性无明显影响。