摘要目的： 探讨CpG-ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells，BMDC）分化成熟的影响。方法： 利用合成的含非甲基化CpG基序的寡核苷酸（CpG motif containing oligonucleotides，CpG-ODN），通过 酶切鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度,FACS 分析DC表型和内吞作用的变化,ELISA检测DC培养上清中IL-12,IL-6,IL-1β和TNF-α和NO的含量。结果： CpG-ODN能够刺激DC前体细胞增殖，提高DC MHCⅡ类分子、B7-2和CD40的表达，明显增加IL-12等细胞因子的分泌，显著增强DC刺激初始型T细胞增殖。结论： CpG-ODN与LPS一样能够促进DC成熟进而增强抗原提呈功能。

《中国图书资料分类法》分类号R392.12

Stimulatory Effect of CpG-ODN on the Differentiation and Maturation of Bone Marrow-Derived Dendritic Cells

Wang Wenya, Yu Yizhi, Zhang Minghui, Liu Shuxun, Li Yongjian, WangYiqiang, Cao Xuetao

(Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)

AbstractObjective: To investgate the effect of immunostimulatory CpG-ODN on the differentiation, maturation of bone marrow-derived dendritic cells (BMDC).Methods: Methlylation of DNA was identifiedat by restrictive enzymes. The expression of surface molecules associated with antigen presentation on CpG-ODN-stimulated BMDC and antigen uptake of BMDC were analyzed by FACS analysis. Levels of immunoregulatory cytokines in supernatants were detected by ELISA. The stimulatory effect of CpG-ODN-activated DC on proliferation of allogeneic T lymphocytes was examined by ［³H］-TdR incorporation.Results: CpG-ODN had significant effect on the proliferation of DC progenitor and could up-regulate expression of B7-2,CD40 and MHC classⅡon the immature and mature BMDC, However, ZpG-ODN or Non-ODN, which contained methylcytosine or GC motif instead of unmethlyated cytosine as part of the CpG-ODN, had little effect on BMDC. Besides, CpG-ODN-stimulated DC produced high levels of IL-12, IL-6 and IL-1βin the supernatants but little TNF-α. The proliferation of naive T cells induced by CpG-ODN-stimulated DC was significantly enhanced. FACS analysis showed that the endocytic capacity of CpG-ODN-stimulated DC weaken obviously. Conclusion: CpG-ODN,like LPS has remarkable stimulatory effect on DC differentiation, maturation and antigen-presenting function.

Key wordsdendritic cells; CpG motif; oligonucleotides; differentiation; maturation

树突状细胞(dendritic cells, DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，在免疫反应中起着举足轻重的作用^［1,2］。DC是否成熟对其功能的发挥十分重要。目前人们已发现了可以刺激DC成熟的多种因素，如LPS,TNF-α和CD40-CD40L等^［3～5］，并且也在积极寻找新的刺激因素。近年来研究表明，细菌基因组DNA因含有非甲基化的CpG基序可以有效地活化APC，具有较强免疫刺激活性^［6］。由于来自细菌的LPS具有明确的诱导DC成熟并影响其功能的作用，由此设想同样来自细菌的非甲基化CpG基序很可能对DC分化发育和功能有一定的影响。据此，本研究合成了含非甲基化CpG基序的寡核苷酸（CpG motif containing oligonucleotides，CpG-ODN）并提取了细菌DNA（E.coli.DNA, EC DNA），研究了它们对小鼠骨髓来源的DC（bone marrow-derived DC，BMDC）分化发育的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂、动物和细胞株

基因工程小鼠GM-CSF由本室制备纯化（纯度98%，与mGM-CSF标准品对比,确定其比活性3×10⁷ U/mg），T细胞尼龙柱均购自Sigma公司；mIL-4、抗小鼠Ia^b-FITC，CD11c-PE，B7-2-PE，CD40-FITC购自PharMingen公司；小牛胸腺DNA(CT DNA)购自Sigma公司；小鼠细胞因子检测试剂盒购于Endogen 公司；［³H］-TdR购自Amersham公司；细菌脂多糖（LPS）和OVA-FITC购自Sigma公司。C57BL/6（H-2^b）、BALB/c(H-2^d)/c小鼠,雌性，6～8周龄，购自上海比凯实验动物有限公司。

1.2细菌基因组DNA和寡核苷酸(ODN)的制备

1.2.1大肠杆菌基因组DNA（E.coli.DNA）

制备方法见参考文献［7］。

1.2.2人工合成的寡核苷酸（phosphorothioate oligonucleotides，S-ODN）

含有非甲基化的CpG 基序的寡核苷酸CpG-ODN (TCCATGACGTTCCTGATGCT)、不含CpG 基序的寡核苷酸Non-ODN（TCCATGAGCTTCCTGATGCT）以及含甲基化的CpG基序的寡核苷酸ZpG-ODN (TCCATGA^mCGT TCCTGATGCT)均由赛百盛公司合成。所有碱基均硫代处理。

1.3DNA制品甲基化分析

参考文献［8］方法。

1.4小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）体外培养扩增及鉴定

参考Inaba等方法^［9］并稍加改进。无菌取 C57BL/6小鼠股骨骨髓细胞，Tris-NH₄Cl溶解红细胞，经大鼠抗小鼠CD4，CD8，B220/CD45RIa和FCR单抗及补体（10∶1稀释）介溶后的骨髓细胞（1×10⁶/ml）在含有mGM-CSF（20 ng/ml）和mIL-4（1 ng/ml）的RPMI 1640完全培养基培养。第3天，吸弃培养基及悬浮细胞，补充新鲜培养基,mGM-CSF和mIL-4，继续培养至第4天收集疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，置新培养基过夜，收集悬浮细胞即为富集的第5天BMDC。所获DC经流式细胞仪（FACS calibur,B.D.公司）进行细胞表型分析鉴定。

1.5DC细胞表型和内吞OVA-FITC的FACS分析

收集与ODN共同孵育18 h后的BMDC，加入抗小鼠Ia^b-FITC，CD11^c-PE，B7-2-PE，CD40-FITC，终浓度5 μg/ml，置4℃标记45 min。流式细胞仪检测DC表面标志的几何平均数（Go mean）和百分数（Gate %）。

另取与ODN共同孵育18 h后的BMDC，置冰上预冷10 min后，加入预冷OVA-FITC (10 μg/ml)，置37℃，5%CO₂孵育30 min，以流式细胞仪检测荧光程度。

1.6不同ODN对BMDC的处理

收集第5天BMDC，铺于24孔培养板（1×10⁶细胞/孔），分别加入CpG-ODN及相应对照物至10 μg/ml，置37℃, 5%CO₂孵箱培养18 h，收集各孔细胞和培养上清。细胞由FACS分析表面分子，培养上清检测IL-12(p70)，IL-6，TNF-α和IL-1β的分泌水平。

实验分组: ① CpG-ODN 10 μg/ml； ② ZpG-ODN 10 μg/ml； ③ Non-ODN 10 μg/ml； ④ EC DNA 10 μg/ml； ⑤ CT DNA 10 μg/ml； ⑥ LPS 1 μg/ml; ⑦ PBS空白对照。

1.7细胞因子的检测

收集BMDC的培养上清按ELISA试剂盒说明检测IL-12(p70)，IL-6，TNF-α和mIL-1β的水平。

1.8BMDC培养上清中NO的含量测定

采用Griess试剂检测NO分泌的水平^［11］。

1.9不同ODN处理的DC刺激同种异体T细胞增殖反应的检测（MLR）

无菌制备BALB/c小鼠脾细胞悬液，采用尼龙毛柱过滤法分离T细胞，作为反应细胞；取经不同ODN处理18 h的第5天BMDC经4 000 rad放射线灭活后，作为效应细胞，效靶比为 100∶1，30∶1和10∶1。置37℃,5%CO₂孵箱中培养96 h，于培养结束前18 h加入［³H］-TdR （l μCi/孔）。收集细胞,液闪计数仪检测cpm值，结果以3孔平均值表示。

1.10统计学分析

采用单因素方差分析，组间行q检验比较，P＜0.05时具有显著性差异。

2结果

2.1细菌基因组DNA的鉴定及其甲基化程度的分析

电泳结果显示，E.coli. DNA可被HpaⅡ酶顺利切割成小片段，而CT DNA因CpG基序多为甲基化而几乎不能被切割。由于DNA对HpaⅡ酶切割的敏感性能够反映其CpG基序的甲基化程度，结果表明，制备的EC DNA具有一定的非甲基化CpG基序。

2.2CpG-ODN对BMDC培养早期的骨髓细胞的促增殖作用

CpG-ODN与富集的第4天BMDC 作用34 h，细胞增殖结果显示，CpG-ODN处理组的骨髓细胞增殖明显（P＜0.01），ZpG-ODN，Non-ODN共育的DC与空白对照比较，增殖程度无显著差别（P＞0.05）（结果未显示）。提示CpG-ODN能够促进体外DC前体细胞的增殖。

2.3CpG-ODN 对BMDC表面标志的影响

结果显示（图1），空白对照组BMDC（正常培养的第6天BMDC）MHCⅡ类分子（Ia^b）的表达并不均一，约50％未达到高