摘要目的： 观察CD基因联合mIL-2/mGM-CSF基因对小鼠胃癌的治疗作用。方法： CD基因构建于逆转录病毒载体pLxSN，mIL-2和mGM-CSF基因构建于pIRES。先用CD/5-FC治疗胃癌细胞株，然后联合mIL-2/mGM-CSF两种细胞因子基因治疗小鼠模型胃癌，以期产生显著的抗肿瘤作用。RT-PCR检测基因表达。结果： 体外结果显示20%的转基因细胞即可杀灭70%～80%的肿瘤细胞。动物实验结果表明，应用CD/5-Fc，即可产生很强的抗肿瘤作用。结合mIL-2/mGM-CSF两种细胞因子基因，抗肿瘤作用会得到进一步强化，肿瘤消退速度明显加快，大部分肿瘤完全消退。RT-PCR结果显示，CD基因和mIL-2，mGM-CSF基因均能在组织中表达。结论： CD/5-Fc能够杀灭肿瘤细胞，具有显著抗肿瘤作用。联合IL-2/GM-CSF后，抗肿瘤作用会得到进一步强化，产生明显的抗肿瘤效应。应用病毒和脂质体方法转染自杀基因和细胞因子基因，可以在组织中满意表达。

《中国图书资料分类法》分类号R735.2； R730.54

Combined Therapy of CD Gene and mIL-2/mGM-CSF Genes for Gastric Cancer

Guo Shanyu, Gu Qinlong, Liu Bingya, Zhu Zhenggang, Yin Haoran, Lin Yanzhen

(Department of Surgery, Shanghai No.9 People′s Hospital, Shanghai 200011)

Abstract Objective: We combined the CD gene and mIL-2/mGM-CSF genes to treat murine gastric cancer, the aim is to produce marked anti-tumor effect.Methods: CD gene was constructed into the retroviral vector pLxSN, the mIL-2 and mGM-CSF genes were inserted into the eukaryotic expressing vector pIRES. In vitro, the murine gastric cancer cells were transfected with retroviral serum and treated with 5-FC; In vivo, the murine model gastric cancer tumor were transfected with retroviral serum, while the mixtures of cytokine plasmid and liposome were injected into the tumor-surrounding tissue, 5-FC was injected into peritoneal cavity.Results: In vitro experiment, 20% of the transduced cells could give rise to 70%～80% of the total cells to death. In vivo results showed that no treatment effect was found in control group. CD/5-FC could inhibit the tumor growth. The strongest anti-tumor effect was shown in the CD/5-FC+mIL-2+mGM-CSF group. The pathologic examination showed necrosis in the treated groups. With the RT-PCR, we examined the expression of interest genes on the mRNA level. The suicide gene and cytokine gene were all expressed in the tissues.Conclusion: CD/5-FC can kill tumor cells in vitro and inhibit the tumor growth in vivo. IL-2 and GM-CSF could strongly enhance the anti-tumor effect. Through the retrovirus and liposome methods, the suicide gene and cytokine genes were all expressed in the tissues.

Key words gastric cancer; suicide gene; cytokine; retrovirus; RT-PCR

胃癌是威胁人类最常见的恶性肿瘤之一，目前的治疗方法主要是手术和化疗，但对中晚期胃癌的疗效却欠理想。基因治疗为胃癌等恶性肿瘤的治疗开辟了新的途径。“自杀基因”即为目前研究较多的肿瘤治疗基因之一。这类基因主要包括大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因(cytosine deaminase-E. coli, CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplx virus-thymidine kinase, HSV-TK)等。它们的作用机理是将本来对哺乳动物细胞无毒性的药物（称为前药）转化为有毒性的药物导致转基因细胞的死亡^［1，2］。此外，细胞因子在抗肿瘤免疫中也发挥重要作用。IL-2能激活NK，LAK细胞和CD8⁺T淋巴细胞，对肿瘤细胞产生直接杀伤作用^［3］；GM-CSF在肿瘤免疫中能促进巨噬细胞等抗原提呈细胞对肿瘤抗原的提呈作用^［4］。

我们将CD基因联合mIL-2和mGM-CSF两种细胞因子基因治疗小鼠胃癌，以期产生显著的抗肿瘤作用。

1材料与方法

1.1表达载体的构建

CD基因1.2 kb通过酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ构建于逆转录病毒载体pLxSN；mIL-2 (530 bp)和mGM-CSF(450 bp)通过RT-PCR方法从小鼠脾脏中获得，并经测序鉴定正确，它们通过酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ构建于真核表达载体pIRES。

1.2细胞株和细胞培养

MFC细胞为615小鼠前胃胃癌细胞，培养基为DMEM，含10%小牛血清，置37℃培养箱培养。PA317细胞为包装细胞，在DMEM培养液中生长良好。NIH3T3用作病毒滴度的测定。

1.3逆转录病毒质粒转染包装细胞并收集上清和测定滴度

1.3.1应用脂质体方法转染逆转录病毒质粒转染PA317细胞，48 h后更换含 G418的完全DMEM， G418 600 μg/ml，每3 d更换1次；2周后大部分细胞死亡，只剩下少数转染阳性细胞。克隆扩增并收集上清，用3T3细胞测定滴度。

1.3.2带报告基因阳性克隆的筛选

将报告基因LacZ构建于逆转录病毒载体pLxSN，按同上方法转染包装细胞，用X-gal染色。

1.4重组逆转录病毒上清感染MFC胃癌细胞株

取最高滴度病毒液感染MFC细胞， G418 筛选，最后剩下感染病毒的细胞，并形成克隆。

1.5体外试验

1.5.1药物敏感性检测

将转基因MFC细胞按1×10⁴/孔接种96孔板,并以不同浓度分别加入前药5-FC，连用7 d后，观察细胞存活情况，并用MTT法测定存活细胞比率。酶标仪测定OD₄₉₀值：

1.5.2体外旁观者效应检测

将转基因的MFC细胞与未转基因的MFC细胞分别按不同的比例混合，接种于96孔板(1×10⁴/well)，第2天开始应用前药5-FC(500 μg /ml)，连用7 d。观察细胞存活情况，并用MTT法测定存活细胞比率。

1.6体内试验

1.6.1动物分组和模型制备

40只615小鼠全部为雌性，6～8周龄，应用皮下注射法建立MFC细胞胃癌模型，然后随机分为4组：①对照组：10只，瘤体内注射生理盐水，不用病毒上清，经腹腔注射5-FC。②CD/5-FC组：10只，瘤体内应用病毒上清，经腹腔应用5-FC。③ CD/5-FC+mIL-2组：10只，应用CD/5-FC的同时，联合应用mIL-2。④ CD/5-FC+mIL-2+mGM-CSF组：10只，应用CD/5-FC的同时，联合应用mIL-2和mGM-CSF。

1.6.2转染病毒上清和细胞因子基因

分别向瘤内注射病毒上清（含有20 μg/ml polypene）100 μl/次，每周2次，连续2周。对照组向瘤体内注射生理盐水。细胞因子质粒通过阳离子脂质体转导(按说明)。

1.6.3应用前药和测定肿瘤大小

转染病毒上清3 d后开始向腹腔内注射前药， 5-Fc用量为500 mg*kg^-1*d^-1，连用3周。每5 d测定肿瘤大小，取最大径和最小径，肿瘤体积1/2 AB²。

1.6.4体内转基因表达检测

切取部分转基因组织用Trizol试剂抽提RNA，进行RT-PCR反应。

CD基因的引物序列：上游序列：5′-GTGAATT CAGGCTAGCAATGTCGAATAACGCT-3′; 下游序列：5′-GTGGATCCTCAACGTTTGTAATCGATGGCTTC-3′; mβ-actin基因的引物序列为：上游序列：5′-TGACGGGGTCACCCACAC-3′; 下游序列：5′-CTAGAAGCACTTGCGGTG CACG-3′。

CD基因的PCR反应条件为： 95℃变性5 min，95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延长3 min，重复循环39次，72℃延长7 min。

β-actin基因的PCR反应条件为：95℃变性5 min，95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延长1 min，重复循环39次，72℃延长7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

mIL-2上游引物：5′-TCGAATTCTGTACAGCATGCAGC TC-3′,下游引物：5′-TGGATCCGGTACATAGTTATTGAGG GC-3′; mGM-CSF上游引物：5′-CGGAATTCATGTGGCT GCAGAAT-3′, 下游引物：5′-CGGAATTCTTCAGAGCTGG CCTG-3′。

反应条件均为：95℃变性5 min 95℃变性1 min,55℃ 退火50 s,72℃延长1 min,重复30个循环;72℃ 延长8 min。产物行琼脂糖凝胶电泳。

1.7统计分析

将肿瘤体积测定结果进行方差分析。

2结果

2.1转染质粒

应用脂质体方法将质粒转染包装细胞，应用G418 600 μg/ml 5～7 d，即开始有大量细胞死亡，2～3周后开始有少量贴壁细胞向外生长，与大量死亡细胞形成