摘要目的: 研究淫羊藿甙(ICA)对PG细胞分泌转化生长因子β₂(transforming growth factor β₂，TGFβ₂)的影响、ICA逆转TGFβ₂介导的免疫抑制作用及其机制。方法: MTT法检测细胞增殖、杀伤活性，RT-PCR检测TGFβ₂、穿孔素，流式细胞术检测TGFβ₂、IL-2Rα水平。结果: ICA可抑制PG细胞中TGFβ₂的蛋白和mRNA表达,能够逆转受TGFβ₂抑制的LAK和CD3AK细胞的杀伤活性，并能部分恢复受TGFβ₂抑制的LAK细胞表面IL-2Rα表达和CD3AK细胞内穿孔素mRNA水平,以及CD3AK细胞的增殖活性。结论: 淫羊藿甙通过抑制肿瘤细胞免疫抑制因子TGFβ₂的产生,增强免疫效应细胞的杀伤活性等机制而发挥抗肿瘤作用。

《中国图书资料分类法》分类号R730.5

Reversion of Transforming Growth Factor β₂ Mediated Immunosuppression in Lung Cancer by Icarrin

Li xiaoyanZhang LingWang YunMao Haiting, Cui Shulin

(Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062)

AbstractObjective: To investigate the influence of Icarrin(ICA) on transforming growth factor β₂ (TGFβ₂) expression by PG cells and the mechanisms of reversion of TGFβ₂ mediated immunosuppression by ICA. Methods: Cell proliferation and cytotoxicity were assayed by MTT assay. mRNA level of TGFβ₂ and perforin was detected by RT-PCR assay. Expression of TGFβ₂ and IL-2R_α was analysed by folw cytometry assay. Results: ICA could inhibit the protein and mRNA expression of TGFβ₂ in PG cells. It could also reverse the supressed cytotoxicity of LAK, CD3AK cells by TGFβ₂. The IL-2R_α expression on LAK and perforin gene transcription and proliferation of CD3AK inhibited by TGFβ₂ were also partly recovered. Conclusion: The anti-tumor activity of ICA is at least partly due to its capability of inhibiting TGFβ₂ expression in tumor cells and restoring the cytotoxicity of immunocompetent cells inhibited by TGFβ₂.

Key wordsICA; transforming growth factor β₂; immunosuppression

肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与机体免疫系统相互作用中导致免疫监视功能降低的结果。多种肿瘤细胞可分泌免疫抑制因子TGFβ,它能强烈地抑制T细胞的增殖及CTL,NK,Mψ,LAK,CD3AK,TIL细胞的杀伤活性^［1］,并与过继免疫治疗疗效不佳有直接关系,如果能够抑制TGFβ的分泌并阻断其免疫抑制作用,将有利于控制肿瘤的发展,提高肿瘤的治疗效果。淫羊藿甙(ICA)是一种免疫增强剂和抗肿瘤制剂,具有调节免疫功能,诱导白血病细胞分化、凋亡,逆转实体瘤细胞恶性表型等作用。本文对ICA抑制人肺癌PG细胞分泌TGFβ₂，逆转TGFβ₂的免疫抑制作用及其机制进行研究,以阐明ICA抗癌作用的新机制。

1材料与方法

1.1材料

淫羊藿甙(ICA)从朝鲜淫羊藿中提取,纯度96%以上,性质稳定。全反式维甲酸(ATRA)为本所姜国胜副研究员惠赠；rhTGFβ₂购自Sigma公司;rhIL-2购自北京瑞得合通有限公司;CD3单克隆抗体为本所田志刚研究员惠赠；FITC-CD2单抗,FITC-CD16单抗,CD4-FITC,CD8-PE,CD3PE-Cy5单抗均为Immunotech公司产品；小鼠抗人TGFβ₂多抗FITC-羊抗小鼠多抗、Random Primer购自华美公司；TRIzol Reagent购自GIBCO-BRL公司;DEPC,dATP,dTTP,dGTP,dCTP,M-MLV Reverse Transcriptase,Taq DNA Polymerase,RNasin均购自Promega公司；人肺巨细胞腺癌PG，人髓样白血病K562细胞为本室保存癌系。

1.2PCR扩增引物

第1种β-actin正引物序列为5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′负引物序列为5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′,扩增片段大小为318 bp,购自北京医科大学病理系。第2种β-actin引物的正引物序列为5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′,负引物序列为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,扩增片段大小为500 bp,由赛百盛公司合成。穿孔素正引物序列为5′-TGTATGATGGCTGGGG-3′,负引物序列为5′-CCTGTGGTAAGCATGCT-3′,片段大小为523 bp,由赛百盛公司合成。TGFβ₂引物由浙江大学董海涛教授惠赠。

1.3流式细胞术检测ICA对PG细胞TGFβ₂蛋白表达的影响

参照文献［2］进行检测。

1.4RT-PCR法检测ICA对PG细胞TGFβ₂ mRNA表达的影响

各组PG细胞总RNA提取按TRIzol Reagent说明书操作,逆转录和PCR扩增参照文献［3］进行。

1.5LAK和CD3AK细胞的诱导培养及ICA，rhTGFβ₂的处理

健康人外周抗凝血经淋巴细胞分离液分离PBMC,调整细胞浓度至1×10⁶/ml,加入IL-21 000 U/ml诱导LAK细胞;加IL-2 100 U/ml,CD3单抗0.1 μg/ml诱导CD3AK细胞。两诱导系均设①常规诱导对照组②25，50 μg/ml ICA处理组③rhTGFβ₂ 5，10 ng/ml处理组④逆转组rhTGFβ₂ 5，10 ng/ml+ICA 50 μg/ml。各诱导处理组细胞置37℃,5%CO₂饱和湿度培养,其中rhTGFβ₂组和逆转组均在第3天补加相同浓度的rhTGFβ₂。

1.6MTT法检测ICA逆转TGFβ₂对LAK和CD3AK细胞杀伤活性的抑制作用^［4］

收集培养至第3天的各处理组LAK、第4天的CD3AK细胞，以PG和K562为靶细胞,设不同效靶比(6.25∶1, 12.5∶1, 25∶1, 50∶1)实验组,另设靶细胞对照和效应细胞对照,每组3个复孔,置37℃,5%CO₂孵箱中培养24 h,测定各组杀伤活性。

1.7MTT法检测ICA和TGFβ₂对CD3AK增殖的影响

将各处理组CD3AK细胞1×10⁶/ml接种于96孔板中,每孔200 μl,培养至3， 4， 6 d,检测增殖活性。

1.8流式细胞术检测ICA逆转TGFβ₂对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用

收集培养至3 d的LAK各处理组细胞,参考文献［2］进行检测。

1.9RT-PCR法检测ICA逆转TGFβ₂对CD3AK细胞穿孔素mRNA水平的抑制作用

参考文献［3］进行。

1.10RT-PCR产物定量

Gel Dos1000凝胶图像分析仪扫描底片各带,以β-actin为内参照,测定TGFβ₂和穿孔素基因mRNA相对表达量。

1.11统计处理

t检验、x²检验。

2结果

2.1ICA处理后对PG细胞TGFβ₂蛋白表达的影响

正常对照组PG细胞TGFβ₂表达率为73.26%,阳性对照ATRA 10^-5 mol/L处理PG 细胞48 h和72 h后,TGFβ₂表达率降至51.94%和59.66%(P＜0.01),100 μg/ml, 200 μg/ml ICA 处理PG细胞48 h和72 h后,TGFβ₂表达率分别降至47.73%和64.51%, 46.32%和60.20%(P＜0.01),呈剂量依赖效应,各药物均以48 h作用最明显。

2.2ICA对PG细胞TGFβ₂ mRNA表达的影响

PG细胞TGFβ₂基因mRNA相对表达量为0.9422(图1B),ICA 100 μg/ml, 200 μg/ml处理细胞48 h后,与正常对照相比,TGFβ₂基因mRNA扩增条带变浅,相对表达量有不同程度下降,分别为0.6806, 0.2999(图1C，D)。

图1TGFβ₂基因RT-PCR扩增片段的电泳分析结果

Fig lDNA electrophoresis of TGFβ₂ gene mRNA

expression of control amd treated PG cells by ICA

Lane A: PCR marker; Lane B: Control; Lane C: ICA 200 μg/ml

treatment; Lame D: ICA 100 μg/ml treatment

2.3ICA逆转TGFβ₂对LAK细胞杀伤活性的抑制作用

在诱导起始阶段加入10 ng/ml rhTGFβ₂,LAK细胞对PG细胞、K562细胞的NK样杀伤活性显著降低，而ICA 50 μg/ml不仅可显著提高LAK杀伤活性提高,并可阻断rhTGFβ₂的抑制作用,将受抑的LAK杀伤活性恢复至正常水平(表1，2)。

表1各处理组LAK细胞对PG细胞的杀伤活性

Tab. 1The killing activi