摘要目的： 为了研究抗MDR1核酶逆转肿瘤细胞中P-gp介导的多重耐药性(MDR)的作用。 方法： 首先，我们建立了单纯由P-gp介导的、20倍耐药的人Daudi淋巴瘤细胞的模型-Daudi/MDR20。同时我们将表达不同抗MDR1核酶的逆转录病毒载体（N2A+tRNA_i^met-196MDR1-Rz，N2A+tRNA_i^met-196MDR1-sRz 和 N2A+tRNA_i^met-iMDR1-sRz）转染到GP+envAM12细胞中进行包装，获得了高滴度的病毒［（1.1～2.5）×10⁵ cfu/ml］。后者用于感染Daudi/MDR20。结果： 通过一系列分子生物学检测证实,携带3种核酶的逆转录病毒不但整合到DNA中，而且也高水平表达相应的核酶tRNA_i^met-iMDR1-sRz，tRNA_i^met-196MDR1-sRz 和tRNA_i^met-196MDR1-Rz。结果表明,tRNA_i^met-iMDR1-sRz和tRNA_i^met-196MDR1-sRz转导的Daudi/MDR20细胞完全逆转了对长春新碱的敏感性，并伴随着MDR1 mRNA和P-gp表达的阻断。结论： 逆转录病毒载体高效介导的抗MDR1核酶的基因转移能够完全逆转肿瘤细胞中P-gp依赖的MDR。

《中国图书资料分类法》分类号Q97

Anti-MDR1 Ribozymes Mediated by Retroviral Vector Efficiently Reverse the Multidrug Resistance (MDR) in Resistant Human Lymphoma Daudi Cells

Wang FushengJin LeiLei ZhouyunH. KobayashiT. Ohnuma

(Beijing Institute of Infectious Diseases, No. 26 Feng-Tai Road, Beijing 100039)

AbstractObjective： In order to explore the reversal of the multidrug resistance(MDR) purely related to P-glycoprotein expression by using the anti-MDR1 ribozyme genes. Methods： Daudi human lymphoma cells 20-fold resistant to vincristine (VCR)(Daudi/MDR20) were developed.Three retroviral vectors highly expressing the anti-MDR1 ribozymes: 196MDR1-Rz, 196MDR1-sRz and iMDR1-sRz were also constructed and transfected into GP+envAM12 cells for packaging. The viral supernatants with high titers ［(1.1～2.5)×10⁵ cfu/ml］ were used to infected Daudi/MDR20 cells. Results： The tRNAimet-iMDR1-sRz and tRNAimet-196MDR1-sRz-transduced Daudi/MDR20 cells effectively restored chemosensitivity to VCR and were accompanied by blocked expression of MDR1 mRNA and P-glycoprotein as well as overexpression of anti-MDR1-Rzs. Conclusion: The high level expressions of anti-MDR1 ribozymes mediated by retroviral vectors appear to have contributed to the efficinet reversal of P-gp-mediated MDR in tumor cells.

Key wordsmultidrug resistance (MDR); ribozyme; tumor cells; retroviral vector

化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，然而，肿瘤细胞中多重耐药性（multidrug resistance, MDR）的出现严重地阻断了化疗药物的抗肿瘤效应，因此，逆转MDR、提高化疗的成功率是肿瘤治疗中亟待解决的难题。现已证实肿瘤细胞高水平表达MDR1 mRNA和P-gp是MDR中最常见的形式^［1,2］，因此抗MDR1的核酶阻断MDR是特异的、有效的策略之一。

近年来，文献报道的抗MDR核酶均没有完全实现对MDR的逆转。其原因可能是靶细胞都是药物诱导的MDR阳性的肿瘤细胞，因而可能存在非P-gp介导的MDR，或向靶细胞中转导的核酶量不足。为解决这两个问题，我们建立了由单纯P-gp介导的MDR阳性的Daudi/MDR20细胞模型^［3］。同时构建了高效表达嵌合型核酶逆转录病毒载体^［4,5］。结果表明，能有效逆转肿瘤细胞的MDR表型。现将研究结果报道如下。

1材料与方法

1.1细胞系

Daudi细胞系（Daudi/wt）来自美国ATCC，在加入20%FBS的RPMI 1640培养基中培养。GP+env AM12包装的细胞系和NIH/3T3细胞系在含10%热灭活的FBS的DMEM培养基中培养。本实验所用的牛血清和培养基均购自GIBCO公司。

1.2制备耐药的Daudi/MDR20细胞系

第一步是含表达全长MDR1基因的pHaMDR1/A在GP+envAM12细胞中进行包装，方法同文献［3］。从稳定转导细胞中收集的上清通过0.45 μm滤膜过滤、分装、并保存于-70℃。经检测病毒滴度为(1.5～2.0)×10⁵ cfu/ml^［5］。

第二步是将2×10⁶ Daudi/wt细胞悬于10 ml RPMI 1640培养基中，在含有8 μg/ml 聚乙胺（polybrene)情况下，用包装好的pHaMDR1/A感染细胞。3次感染后，耐药的细胞（称作Daudi/MDR20）生长于选择性RPMI 1640培养基中(含20%FBS和1×10^-8mol/L VCR)。而原来的Daudi/wt细胞不能在VCR选择培养基中存活^［5］。

1.3表达嵌合型核酶的逆转录病毒载体的构建

我们在196MDR1-Rz（催化切割MDR1 mRNA第196位GUC编码子）研究基础上^［1］，为了增加核酶结构上的稳定性，对核酶Stem-Ⅱ结构中的4个碱基进行了改变，即设计了196MDR1-sRz (U₉→G₉,U₁₃→A₁₃,G₁₄→A₁₄,A₁₈→C₁₈)^［5］。除了196MDR1-sRz外，我们还设计了stem-Ⅱ上经过修饰的、针对MDR1 mRNA转录起始部位的-6～-4 GUC编码子的核酶（iMDR1-sRz）。此外,在实验中还设计了点突变的修饰而丧失生物学活性的mut-iMDR1-sRz（G₃→U₃,A₂₂→C₂₂）和原有的196MDR1-Rz作为必要的对照。将锤头状核酶cDNA分别被插入N2A+tRNAimet载体的Sac Ⅱ/Mlu Ⅰ位点中，形成了N2A+tRNA_i^met-196MDR1-Rz，N2A+tRNA_i^met-196MDR1-sRz，N2A+tRNA_i^met-iMDR1-sRz 和N2A+ tRNA_i^met-mut-iMDR1-sRz，在Poly Ⅲ启动子的作用下，可高效表达嵌合型核酶分子^［5］。

1.4携带核酶基因的逆转录病毒载体的包装及其转导Daudi/MDR20细胞

第一步：携带不同核酶基因的逆转录病毒载体N2A＋tRNA_i^met-196MDR1-Rz，N2A+tRNA_i^met-196MDR1-sRz，N2A+tRNA_i^met-iMDR1-sRz和N2A+tRNA_i^met-mut-iMDR1-sRz 在GP+envAm12细胞中包装方法同前。病毒滴度为(1.1～2.5)×10⁵ cfu/ml。

第二步：在10 ml含有8 μg/ml 聚乙胺的RPMI 1640的培养基中，1×10⁶ Daudi/MDR20细胞经过逆转录病毒的感染的步骤同1.2。根据感染的逆转录病毒载体的不同，G418筛选的Daudi/MDR20细胞被分别命名为Daudi/MDR20-196MDR1-Rz,Daudi/MDR20-196MDR1-sRz,

Daudi/MDR20-iMDR1-sRz和Daudi/MDR20-mut-iMDR1-sRz，

将它们分别培养于含20%FBS的RPMI-1640培养基中。

1.5MTT检测

Daudi/wt，Daudi/MDR20和核酶转导的Daudi/MDR20等细胞对VCR的敏感性通过MTT方法确定^［1］。

1.6Northern杂交和Southern印迹

为确定Daudi细胞中MDR1的表达及P-gp的产生，分别进行Northern杂交和Western Blot的检测^［7，8］。Western分析用ECL Western Blotting试剂盒(Amersham公司)和C₄₉₄鼠抗人P-gp单抗(Signet公司)^［1］。Northern Blot 分析所使用的总细胞RNA用TRIzol试剂(Life Technologies公司)提取。RNA电泳、转移至硝酸纤维素膜及杂交以标准方法进行。全长MDR1 cDNA用［γ-³²P］ dCTP标记并作为杂交探针^［7］。

1.7PCR和RT-PCR检测

用PCR方法证实逆转录病毒能否整合到靶细胞染色体DNA上。PCR引物1: 5′-AACAGCAGAGTGGCGCA GCGGAA-3′(23 mer),引物2：5′-GACCTTGATCTGAA CTTCTC-3′ (20 mer)。PCR的模板来自于逆转录病毒转导的各亚细胞系的基因组DNA。PCR条件同上^［1］。

用RT-PCR鉴定靶细胞中核酶基因的表达水平。先提取待检测的细胞总RNA，后者经RNase-free DNase Ⅰ消化除去残留的DNA。用GIBCO公司的逆转录试剂盒和Rz-top引物链（5′-AACAGCAGAGTGGCG CAGCGGAA-3′， 23 mer）合成第一条cDNA链。然后，分别用Rz-top和相应的4条链（196MDR1-Rz-bottom, 5′-TCTT TCAGTTTCGTCCTCACG-3′; 196MDR1-sRz-bottom, 5′-TCT TTCAGTTTCGGCCTTTCG-3′; iMDR1-sRz-bottom, 5′-GCG CGAGGTTTCGGCCTTTCG-3′; mut-iMDR-sRz-bottom, 5′-GCGCGAGGTGTCGGCCTTTCG-3′）进行PCR扩增^［1］，反应结束后，分别取10 μl的PCR产物进行琼脂糖电泳分析。

2结果

2．1耐药的系建立Daudi/MDR20细胞

我们用包装的pHaMDR1/A感染Daudi/wt细胞，获得了对VCR耐药的亚细胞系，它的ID₅₀是2.59×10^-8