摘要目的： 探讨化疗的敏感性与细胞凋亡的关系，观察细胞凋亡抑制分子bcl-2在卵巢癌化疗抵抗中的作用。方法： 构建了逆转录病毒bcl-2表达载体pLXSN/bcl-2，应用lipofactin法建立转染bcl-2基因和转染空载体pLXSN的卵巢癌细胞系。MTT法观察细胞系抵抗药物的细胞毒作用。FACS 和DNA琼脂糖凝胶电泳观察bcl-2高表达细胞系在阿霉素诱导细胞凋亡中的变化。结果： 转染bcl-2的卵巢癌细胞系OC3/ bcl-2稳定表达bcl-2分子并抵抗药物介导的细胞毒作用，明显提高细胞的存活率，与此同时也抑制细胞凋亡的发生。结论： 化疗的敏感性与细胞凋亡的调节密切相关，凋亡抑制基因bcl-2在肿瘤耐药中起重要作用。

《中国图书资料分类法》分类号R979.2

The Control of Apoptosis and Drug Resistance in Ovarian Cancer Cells Which Overexpressed bcl-2

Tian FangLi ChunhaiYan ChunhongChen Gaoming

(Laboratory of Onco-Molecular Biology of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850)

AbstractObjective: To investigate whether bcl-2 directly contributes to the development of drug resistance and apoptosis in ovarian cancer cell lines cells OC3. Methods: Retrovirus expression vector pLXSN-bcl-2 was constructed and was transfected to ovarian cancer cell line cells OC3 using Lipofectin, with empty vector pLXSN as a control. bcl-2 expression of transfected cells was analyzed by FACS and Western blot and Adr-induced cytotoxicity was measured by MTT assay. Apoptosis was also detected by PI DNA staining and DNA Ladder analysis. Results: pLXSN/bcl-2 transfected cells OC3/bcl-2 overexpressed bcl-2 and were resistant to Adr-induced cytotoxicity. The ability against Adr-induced apoptosis was increased. Conclusion: bcl-2 may play an important role in the resistance to Adr-inducing apoptosis, thereby increasing resistance of OC3/bcl-2 cells to chemotherapy.

Key wordsbcl-2; ovarian cancer; drug resistance; apoptosis

卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤。化疗在卵巢癌的治疗中占有重要位置，但药物抵抗是化疗失败的主要原因。bcl-2分子与药物抵抗的关系日益受到重视。 随着肿瘤细胞耐药与细胞凋亡的关系的深入研究，在多种白血病化疗耐受的研究中发现，bcl-2表达升高是药物耐受的主要机制^［1］。但bcl-2与实体瘤的耐药关系还有待阐明。本文建立了卵巢癌细胞系OC3 bcl-2高表达细胞系，观察了在阿霉素诱导细胞凋亡中的变化,目的是深入认识高表达的bcl-2在卵巢癌化疗抵抗中的作用，为克服和逆转肿瘤耐药提供理论基础。

1材料与方法

1．1质粒

pBluescript SK-bcl-2质粒：约4.0 kD，含有 bcl-2全长 cDNA序列，由颜春洪博士后惠赠。

1．2pLXSN逆转录病毒载体

含MOMSV的5′-LTR和MOMlY的3′-LTR，在5′-LTR的下游有EcoRⅠ多克隆酶切位点，以 neo基因表达产生的G418抗性来筛选阳性克隆，由颜春洪博士后惠赠。

1．3酶类

EcoRⅠ, Xho Ⅰ, T₄ligase 购自Promega 公司。

1．4细胞系

OC3人卵巢癌细胞系,由加拿大温哥华医院健康科学研究中心李吉佑教授惠赠。

1．5主要试剂

RPMI1640，G418，Lipofectin购自GIBCO公司。阿霉素购自深圳万乐药业。bcl-2 McAb购自Santu Cruz公司。Saponin 购自Sigma公司。

1.6pLXSN-bcl-2表达载体的构建

图1pLXSN-bcl-2表达载体的构建

Fig.1Construction of pLXSN-bcl-2 expression vector

首先用EcoRⅠ, XhoⅠ酶切质粒pBluescript SK-bcl-2,回收0.8 kD的bcl-2 cDNA, pLXSN质粒用EcoRⅠ, XhoⅠ双酶切使其线性化,再与bcl-2 cDNA进行定向连接反应,转化JM109 感受态细胞,通过氨苄抗性筛选,得到重组质粒pLXSN-bcl-2。

1．7pLXSN-bcl-2表达载体、pLXSN空载体转染OC3细胞

采用Lipofectin方法转染质粒DNA，G418筛选转染阳性细胞克隆。实验方法严格按GIBCO公司说明书进行。

1．8间接免疫荧光FACS，Western blot检测转染细胞中bcl-2的表达

间接免疫荧光FACS和Western blot 按常规方法进行。细胞裂解后用BCA法测定蛋白浓度（见Sigma产品说明书）调整各细胞蛋白浓度等量上样。

1．9MTT法检测阿霉素对转染细胞存活率的影响

以OC3，OC3/pLXSN，OC3/bcl-2作为阿霉素作用的靶细胞，以每孔5×10³/100 μl, 移入96孔板，培养24 h，每孔加入100 μl不同浓度的阿霉素，每一浓度设3个重复孔，37℃，5%CO₂下继续培养48 h，每孔加入20 μl 5 μg/ml MTT,继续培养4 h，弃上清，加入150 μl DMSO，振荡5 min，酶联仪测A₄₉₅值，结果用存活率表示：

1．10PI染色、DNA琼脂糖凝胶电泳检测阿霉素诱导的细胞凋亡

用Adr 2.5 μmol/L冲击转染细胞2 h，10%小牛血清1640洗细胞2次，重新培养。于12 h，24 h取细胞做PI染色和DNA琼脂糖凝胶电泳。参考文献［2］进行。

2结果

2．1pBlu-bcl-2cDNA重组质粒的酶切鉴定

纯化质粒DNA，经EcoRⅠ,XhoⅠ酶切鉴定，载体分子量，插入片段分子量均正确。测序结果证实插入片段为bcl-2正确序列。

2．2pLXSN-bcl-2 表达载体的构建

为了使外源基因得到有效整合和高表达，我们选择逆转录病毒表达载体。将bcl-2基因定向克隆至pLXSN 载体中，再用 EcoRⅠ,XhoⅠ双酶切，切出0.8 kb的片段(图2)。

图2pLXSN-bcl-2重组质粒的酶切鉴定

Fig.2Identification of recombinant plasmid

pLXSN-bcl-2 by EcoRⅠ and XhoⅠ enzyme digestion

M： λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ； 1,2： pLXSN/bcl-2

2．3卵巢癌OC3/bcl-2高表达细胞系的鉴定

对扩大培养的细胞系进行间接免疫荧光染色、FACS分析，结果发现，转染pLXSN-bcl-2 的细胞系bcl-2 分子高表达；而转染空载体的细胞则不表达 bcl-2 分子, 将 bcl-2 高表达细胞系传代后再作Western blot,bcl-2分子仍然高表达（见图3）。

图3Western blot 检测bcl-2的表达

Fig.3The expression of bcl-2 detected by Western blot

2.4阿霉素介导的OC3/bcl-2 细胞的细胞毒实验

在相同的药物浓度时,OC3/bcl-2 的存活率明显高于OC3和OC3/pLXSN细胞，表明OC3/bcl-2 细胞对阿霉素产生了抗性（见图4）。

2.5PI染色DNA琼脂糖电泳观察阿霉素诱导的细胞凋亡

用2.5 μm阿霉素诱导细胞2 h,继续培养12 h,有约30%OC3细胞发生凋亡,OC3/pLXSN细胞12%发生细胞凋亡,OC3/bcl-2细胞未发生凋亡。24 h后，OC3/bcl-2细胞有40%细胞发生凋亡。图5结果表明,OC3细胞和OC3/pLXSN细胞在药物刺激12 h出现DNA ladder, 而OC3/bcl-2未能观察到DNA ladder。

图4MTT 法检测阿霉素介导的细胞存活率实验

Fig.4Adr-mediated cell viabilitg by MTT assary

图5FACS分析阿霉素诱导细胞Sub-G1比例

Fig.5The Sub-G1 ratio of cells incubated with

Adr by FACS analysis

3讨论

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