摘要目的： 制备抗表皮生长因子受体单克隆抗体(EQ75)与化疗药物阿霉素(ADR)、免疫偶联物(EQ75-ADR)，研究该偶联物对人表皮癌A431的抑瘤作用和小鼠的副作用,为最终应用于临床打下基础。方法： 用改进的戊二醛方法制备EQ75-ADR，MTT法检测EQ75-ADR对人表皮癌细胞A431和对照细胞人羊膜细胞Wish的48h和2h细胞毒作用，建立荷人表皮癌裸鼠模型和C57BL/6J小鼠模型，观察EQ75-ADR的抑瘤作用，比较EQ75-ADR和ADR对C57BL/6J的副作用。结果： EQ75-ADR对 A431细胞有明显的细胞毒作用，体外作用48h，EQ75-ADR对A431细胞的杀伤分别是EQ75，ADR和EQ75与ADR混合物(EQ75+ADR)的50倍，14倍和10倍，而EQ75-ADR对Wish细胞的杀伤只有ADR和EQ75+ADR的1/10，对Wish细胞的杀伤只有对A431细胞的1/300，2 h作用得到类似结果。EQ75-ADR显著抑制裸鼠体内肿瘤的生长，抑制率高达92.2% (P＜0.01)，对C57BL/6J小鼠的副作用明显低ADR。结论： EQ75-ADR具有选择性杀伤作用，在体外和体内对表皮癌均有显著抑制作用，副作用小，在肿瘤生物治疗中具有潜在的应用价值。

《中国图书资料分类法》分类号R979.1； R392.1

Preparation of Anti-EGFR Monoclonal Antibody Immunoconjugate (EQ75-ADR) and It's Inhibitory Effect on Human Epidermoid Carcinoma

He YingZhang ShangquanZhao FengWu ZhenghuaWang YaofaYan Yuanchang

(Shanghai Institute of Cell Biology，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200031)

AbstractObjective: To prepare an immunoconjugate of anti-EGFR monoclonal antibody (EQ75) and adriamycin (ADR) and to investigute it's inhibitory effect on human epidermoid carcinoma (A431) in vitro and in vivo and it's side effect on C57BL/6J mice. Methods: The immunoconjugate (EQ75-ADR) was prepared with an improved glutaraldehyde conjugate method and the cytotoxicity effects of EQ75-ADR on A431 cells and Wish cells were measured by MTT assay. A431 tumor-bearing nude mice and C57BL/6J experimental model were established and were used for testing the inhibitory effects of EQ75-ADR. The side effect of EQ75-ADR was compared with ADR. Results: The EQ75-ADR showed specific cytotoxicity on A431cells, the cytotoxicity of EQ75-ADR was 50-fold, 14-fold and 10-fold more efficient than that of EQ75, ADR and mixture of EQ75 and ADR (EQ75+ADR) respectively. The effect of EQ75-ADR on with cells was 10-fold less efficient than that of ADR and EQ75+ADR. As compared with the cytoxicity effect of EQ75-ADR on Wish cells with A431 cells, it showed 300-fold less efficient. Similar cytotoxicity results were shown in 2 h treatment experimental group. The EQ75-ADR exhibited significant anti-tumor activity on tumor-bearing nude mice, and the inhibition rate is 92.2% (P＜0.01). As compared with ADR, it's side effect was much lower. Conclusion: The EQ75-ADR exhibited targeted delivery and striking anti-tumor activity in vitro and in vivo and this approach appears a promising future for clinic purpose.

Key wordsanti-tumor; immunoconjugate; epidermal growth factor receptor(EGFR)

蒽环类药物阿霉素(adriamycin，ADR)是目前普遍使用的抗癌化疗药物之一。但由于阿霉素的非特异性细胞毒性，在用于治疗肿瘤的同时，常常对正常组织，器官也造成严重的毒副作用，使它在临床上的应用受到了限制。研究表明，抗体导向治疗能有效地减少药物对正常组织的毒副作用，增加肿瘤细胞的药物摄入量而提高治疗指数，已成为癌症生物治疗的重要研究方向之一^［1］。近年来，随着肿瘤分子生物学的发展，国内外研究者发现，表皮癌,膀胱癌，乳腺癌和胶质癌等多种肿瘤细胞表面过度表达表皮生长因子受体(EGFR)^［2］，而且由于EGFR的结构并不随细胞的分裂增殖而改变，所以不存在异质性(heterogeneity)，使抗EGFR单抗具有广谱抗肿瘤作用，避免了单一的肿瘤特异性单抗的局限性，因而是抗肿瘤导向治疗的理想药物载体。

本实验以抗表皮生长因子受体单抗EQ75为载体(本实验室制惫，鉴定^［3］)，采用改进后的戊二醛方法将阿霉素(ADR)与单抗(EQ75)偶联，制备抗体偶联物（EQ75-ADR），研究其对表面过度表达EGFR的人表皮癌细胞A431的体外细胞毒作用和对荷人表皮癌裸鼠治疗作用，比较偶联物与阿霉素对C57BL/6J的副作用，为导向药物应用于临床提供实验依据和理论基础。

1材料与方法

1.1动物

实验BALB/c裸小鼠, 雄性， 5～6周, C57BL/6J小鼠,雄性，6～7周,由中国科学院上海细胞生物学研究所实验动物中心提供。

1.2细胞和抗体

人表皮癌细胞(A431)，人羊膜细胞(Wish)，由中科院上海细胞生物学研究所提供。

抗EGFR抗体EQ75,由本实验室制备，常规导引小鼠腹水的方法大量扩增，用快速蛋白液相色谱系统(FPLC) 经Sepharose Protein G亲和层析柱纯化，PD^-10柱脱盐，经 SDS-PAGE电泳鉴定(图略)。浓缩抗体浓度为3～5 mg/ml，低温保存备用。

1.3偶联物EQ75-ADR的制备和纯化^［4］

EQ75单抗(3～5 mg)，室温下用二硫苏糖醇(DTT, 25 mmol/L）还原，30 min后过PD^-10柱(Pharmacia)除去未反应的DTT，收集还原后的抗体部分；阿霉素室温下与新配的戊二醛反应(分子比1∶1),然后与还原的抗体反应（抗体与阿霉素的分子比为1∶25）,反应混合物在摇床上反应1 h后，过PD^-10柱，除去未反应的游离的阿霉素部分；抗体与阿霉素的分子比通过分别测量偶联物在280 nm和495 nm的吸光度计算，(波长495 nm时，阿霉素的消光系数为196）。

1.4抗体和偶联物免疫活性的鉴定

4℃条件下，A431细胞( 1×10⁶)与100 μl不同浓度(10倍稀释)的抗体或偶联物反应,加入兔抗鼠IgG1-FITC,反应1 h,用流式细胞仪 FACScan(Becton Dicknson)进行定量荧光分析，以非特异性抗体肺癌单抗7D为阴性对照,用所有细胞的平均荧光强度值表示抗体及偶联物与靶细胞的结合力大小。

1.5体外细胞毒作用实验(MTT比色法测定)

1.5.1长时细胞毒作用

人表皮癌细胞A431细胞,加入96孔培养板中(2.5×10⁴/孔)，培养过夜，使细胞贴壁，将细胞分为4组，分别加入不同稀释度(5倍稀释)的单抗，偶联物，阿霉素，及单抗阿霉素混合物(每组药物浓度与偶联物中抗体和阿霉素浓度平行), 每个浓度设3个平行孔；对照孔为RPMI 1640培液，继续培养48 h后，加入噻唑蓝MTT 25 μl/孔(5 mg/ml，Sigma公司)，于 37℃，5%CO₂温箱中培养4～6 h，2 000 r/min离心，弃上清，加入二甲亚砜(DMSO) 150 μl/孔，计算各组药物对细胞生长的抑制率：

同法测定4组药对人羊膜细胞Wish的生长的抑制率。

1.5.2短时细胞毒实验

A431细胞和Wish细胞分别与上述4组药物作用2 h，吸去作用药物，用RPMI培液洗3次，然后加入培液继续培养46 h，同法计算药物的抑制率。

1.6偶联物对荷人表皮癌裸鼠的治疗作用

体外培养人表皮癌细胞A431，制成细胞悬液(2×10⁶细胞/ml)，接种于裸鼠右腋皮下，100 μl/只，接种后10 d，当皮下肿瘤可触及，肿瘤平均直径为3～4 mm 左右时,随机分为4个实验组(单抗，偶联物，阿霉素和PBS组)进行实验，每组5只荷瘤裸鼠，腹腔注射治疗药物，抗体50 μg/g体重，阿霉素1.5 μg/g体重，偶联物(含抗体50 μg，阿霉素1.5 μg/g体重)，隔天注射1次，共10次，对照组注射PBS 1 ml/只，用游标卡尺测量肿瘤长径a(mm)，及相垂直的短径b(mm)，并用公式V(mm³)=(a×b²)×1/2计算体积,治疗结束后处死裸鼠剥离肿瘤称重并进行比较，抑制率(%)=（对照组平均瘤重－实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

1.7偶联物及游离药物对C57BL/6J荷瘤小鼠的副作用比较

同法建立荷人表皮癌C57BL/6J小鼠模型，随机分为4个实验组，抗体组，偶联物组，阿霉素组和对照组，每组5只荷瘤小鼠，咀部注射抗体(25 μg/g体重)，偶联物(含抗体25 μg/g体重，阿霉素0.75 μg/g体重), 阿霉素 (0.75 μg/g体重)和PBS(0.5 ml/只),隔天注射1次，共注射10次，比较偶联物和阿霉素对C57BL/6J荷瘤小鼠的副作用。

2结果

2.1偶联物EQ75-ADR的制备及稳定性

制备的偶联物，经PD^-10柱分离收集(1 ml/管)，其洗脱液经紫外检测，在波长280 nm和495 nm时出现的第一个峰即为偶联物EQ75-ADR，见图1。偶联物中抗体与药物分子比为1∶8～