摘要目的： 探索点突变p53重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应及B7对其加强作用，为重组抗原疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法： 选择人135位Cys→Tyr点突变p53作为肿瘤相关抗原模型，观察以表达该点突变p53的重组痘苗病毒rVV-p53FL单独和联合表达B7的重组痘苗病毒rVV-B7所诱导的CTL及对荷瘤小鼠的免疫保护和治疗作用。 结果: 以rVV-p53FL经静脉免疫BALB/c小鼠能够诱导以CD8⁺ T细胞为主的特异性CTL。rVV-p53FL能够保护部分小鼠免遭肿瘤细胞的攻击。以rVV-p53FL治疗荷瘤小鼠，可显著延长小鼠平均存活期。rVV-B7与 rVV-p53FL以1∶1的比例混合接种可部分加强rVV-p53FL的治疗作用。结论： 肿瘤细胞内过度表达的突变P53蛋白可作为CTL 识别和攻击的靶抗原，以突变P53蛋白作为肿瘤抗原的疫苗可诱导机体产生p53特异性的抗瘤免疫反应。共刺激分子B7可加强肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫反应。

《中国图书资料分类法》分类号R730.51

Antitumor Responses Induced by Recombinant Vaccinia Viruses Expressing p53 and B7

Zhang KeqiangWang JinhuiLi XiusenTang Pei-HsienMao Ning

(Institute of Basic Medical Sciences,

Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850）

AbstractObjective： This study was aimed to explore antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 (rVV-p53FL) and enhancive effects of recombinant vaccinia viruses expressing costimulatory molecule B7 (rVV-B7). Methods: A 135 Cys to Tyr point mutant p53 protein was used as the model of tumor associated antigen. rVV-p53FL and rVV-B7 were used as vaccines to test their induction of CTLs and antitumor immunity. Results: Immunization BABL/c mice with rVV-p53FL could elicited specific CD8⁺ CTLs that could effecively lyse P815-mp53 cells, a transfectant of the murine P815 mastocytoma containing the mutant p53 gene. Treatment with rVV-p53FL could survive a part of mice challenged with 1×10⁶ P815-mp53. Treatment with rVV-p53FL could significantly prolong survival of tumor-bearing mice. Admixture at 1∶1 ratio of rVV-p53FL and rVV-B7 could enhance therapeutic antitumor effects of rVV-p53FL. Conclusion: Mutant P53 over-expressed in tumor cells can render cells targets for specific CTLs generated by immunization with mutant p53 protein based vaccine. Costimulatory molecule B7 can enhance tumor-associated antigen inducing antitumor responses.

Key words

Key wordsp53； B7； recombinant vaccinia virus； antitumor

癌基因和抑癌基因的改变是肿瘤细胞的一种共同现象，突变的癌基因和抑癌基因的产物可以成为免疫系统识别和攻击的靶分子。研究表明，p53突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关，是肿瘤易感基因之一。p53突变是人类肿瘤最常见的基因改变，因而是靶向性肿瘤免疫治疗极具吸引力的靶分子之一。

T细胞激活双信号模式的提出为B7家族作为共刺激分子转导肿瘤细胞增加免疫原性提供了坚实的理论基础。近年来,将B7和肿瘤抗原疫苗联合应用于肿瘤主动免疫治疗的研究表明,B7分子能够辅助或加强多种肿瘤抗原诱导的抗瘤免疫反应^［1］。

本研究选取135位Cys→Tyr点突变P53蛋白为肿瘤相关抗原模型，以转染该点突变p53基因的小鼠肥大细胞瘤P815-mp53为肿瘤细胞模型，研究点突变p53重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应和共刺激分子B7对之的加强作用。

1材料与方法

1.1主要试剂和动物

X-gal,5-Br尿嘧啶脱氧核苷酸(Budr)为Sigma公司产品；Lipofectamine^TM 试剂，G418 为Gibcobrl公司产品；鼠抗人p53单克隆抗体DOI Ⅰ 为SantCruz公司产品；FITC标记的鼠抗人B7-1单克隆抗体MAB104为Immunotech公司产品；包含135位Cys→Tyr点突变人p53基因的质粒pRC/CMV-p53由美国Carbone博士惠赠；质粒pJSA1175和人骨肉瘤TK^-143细胞及野生型痘苗病毒中国天坛761株由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠；DBA/2小鼠肥大瘤细胞P815(H-2^d)为本室传代保存；BABL/c小鼠(H-2^d)，6～8周龄，雌性，由本院动物中心提供。

1.2重组痘苗病毒的构建和鉴定

1.2.1重组痘苗病毒的构建

将含人135位点突变的p53基因和B7-1基因插入质粒pJSA1175的7.5 k启动子下构建重组质粒pJSA1175-p53与pJSA1175-B7。 将TK⁺野生型痘苗病毒(wt-VV)按0.1 PFU(plaque forming unite)/细胞感染TK^-143细胞后，采用Lipofectamine共转染法将重组质粒导入TK^-143细胞，以同源重组的方式获得TK^-重组痘苗病毒。在25 μg/ml Budr和200 μg/ml X-gal筛选下得到蓝色重组痘苗病毒噬斑^［2］。挑取单个蓝斑，纯化5代至蓝斑纯度达到100%，分别命名为rVV-p53FL和rVV-B7。

1.2.2Western blot 检测rVV-p53FL的表达

rVV-p53FL感染TK^-143细胞48 h后，提取细胞总蛋白。用ECL Western bolt 分析系统试剂盒进行P53蛋白的检测，以野生型痘苗病毒感染的TK^-143细胞作为阴性对照。

1.2.3流式细胞术检测rVV-B7的表达

rVV-B7按10 PFU/细胞的剂量感染TK^-143细胞12 h后以FITC直标的鼠抗人B7单克隆抗体标记后，经流式细胞仪分析，计算阳性率，以野生型痘苗病毒感染的TK^-143细胞为阴性对照。

1.3肿瘤细胞系P815-mp53的建立

将质粒pRC/CMV-p53采用Lipofectamine共转染法导入P815细胞，以含600 μg/ml G418的培养液选择抗性克隆，免疫细胞化学染色检测P53蛋白表达，阳性克隆进一步有限稀释再克隆化培养，Western-blot检测P53蛋白的表达，挑选P53表达高全阳性的克隆作为表达突变P53蛋白的肿瘤细胞系命名为P815-mp53，以含600 μg/ml G418的DMEM培养基培养。

1.4CTL细胞毒活性测定

将9只小鼠随机分为3组，分别以1×10⁷ PFU wt-VV，1×10⁷ PFU rVV-p53FL，1×10⁷ PFU rVV-p53FL+1×10⁷ PFU rVV-B7经静脉免疫4周后，常规制备免疫鼠脾细胞悬液。(5～6)×10⁶/ml脾细胞分别与经80 μg/ml丝裂霉素C处理45 min的(2～3)×10⁶/ml P815-mp53细胞等体积混合，以含25 U/ml rhIL-2,2×10^-3mol/L L-谷氨酸，5×10^-5mol/L β-巯基乙醇的培养基培养5 d后，收获脾细胞，用Ficoll(ρ=1.0717)离心，除去死细胞，作为效应细胞^［3］。靶细胞为P815-mp53，以P815细胞作为阴性对照。将效应细胞稀释成不同浓度按100 μl/孔接种于96孔U形底培养板，与100 μl靶细胞(1×10⁴)混合，形成不同的效靶比(E∶T)，以乳酸脱氢酶法测定CTL细胞毒活性。

1.5CTL细胞表型分析

以2 μg/ml的兔抗鼠CD4与CD8单克隆抗体封闭CTL杀伤试验，探证抗CD4与CD8单克隆抗体对CTL杀伤活性的影响。

1.6重组痘苗病毒在体内抗肿瘤的实验研究^［4］

1.6.1保护性实验

将21只小鼠，随机分为3组，分别以1×10⁷ PFU wt-VV,1×10⁷ PFU rVV-p53FL和1×10⁷ PFU rVV-p53FL+1×10⁷ PFU rVV-B7静脉免疫4周后，再经尾静脉接种1×10⁶ P815-mp53细胞，记录各免疫组小鼠的存活期和存活动物数。

1.6.2治疗性实验

将21只小鼠，随机分为3组，小鼠先经静脉接种1×10⁶的P815-mp53细胞3 d后，再分别在接种后的第3,6天以1×10⁷ PFU wt-VV,1×10⁷ PFU rVV-p53FL和1×10⁷ PFU rVV-p53FL+1×10⁷ PFU rVV-B7经静脉免疫治疗各实验组小鼠，记录各免疫组小鼠的存活期和存活动物数。

2结果

2.1Western blot检测rVV-p53FL的表达

rVV-p53FL以10 PFU/细胞的剂量感染TK^-143细胞48 h后，Western blot检测到P53蛋白的表达(图1)。

图1Western blot检测rVV-p53FL的表达

Fig. 1Expression of rVV-p53FL detected by Western blot

2.2流式细胞仪检测rVV-B7的表达

rVV-B7以10 PFU/细胞的剂量感染TK^-143细胞12 h后，流式细胞术<