摘要目的: 了解HSV-tk/GCV系统协同放射治疗对小鼠黑色素瘤的联合杀伤作用。方法： 通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和HSV-tk的融合基因（hytk）导入黑色素瘤细胞中并获得表达，通过体外和C57BL/6小鼠动物实验，检测GCV对转基因细胞的体内外杀伤作用及联合应用放射治疗对黑色素瘤的治疗作用。结果： PCR、RNA Dot blotting、免疫组化检测证实HyTK在转基因细胞的表达，体内外实验示GCV对B16/HyTK细胞有明显的杀伤作用，而对野生型B16细胞无明显杀伤作用（P＜0.05）；联合应用低剂量GCV可使转入hytk基因的黑色素瘤细胞对放疗的敏感性明显增高（SER=1.62），体内实验也证实协同疗法可延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长。结论： HSV-tk/GCV系统协同放射治疗有望成为黑色素瘤基因治疗的一种有效方法。

《中国图书资料分类法》分类号R730.54； R739.5

The Synergism of HSV-tk/GCV System and Radiotherapy in Murine Melanoma

Ye ChuanzhongPei XuetaoLi PenghaoZheng YuhuiLi LiangChen Shiping

(Department of Urology， the Union Hospital，Fujian Medical University， FuZhou 350001)

AbstractObjective: To evaluate the therapeutic efficacy of retroviral-mediated HSV-tk/GCV system combined with radiotherapy on murine melanoma. Methods: By using retroviral-mediated gene transfer technique， hygromycin phospotransferase-thymidine kinase fusion gene(hytk) was transferred into B16 murine melanoma cells. Antitumor effects were observed after γ-rays irradiation with ⁶⁰Co rays as well as GCV treatment. Growth inhibition of melanoma models in C57BL/6 mice by HSV-tk/GCV systems in combination with radiotherapy was observed. Results: B16 cells transduced with hytk gene and treated with low concentrations of GCV， which showed little cytotoxicity alone， were highly sensitive to radiation. The sensitizer enhancement ratio(SER) was 1.62. This radiopsensitization was also obtained in vivo. Conclusion： The addition of retroviral-mediated HSV-tk/GCV gene therapy to standard radiation therapy an improve the therapeutic effectiveness for melanoma.

Key wordsmelanoma； phosphotransferase-thymidine kinase fusion gene； γ-rays

通过逆转录病毒介导，将潮霉素磷酸转移酶和单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因（HSV-tk）的融合基因（hytk）导入黑色素瘤细胞株B16中并获得表达，联合应用放射治疗，通过体外和小鼠动物实验，探讨其协同作用。

1材料与方法

1．1动物、质粒与细胞株

C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，重量18～22 g，购自军事医学科学院动物中心。转染hytk cDNA的逆转录病毒包装细胞PA317/HyTK由笔者保存^［1］。鼠黑色素瘤细胞株B16由军事医学科学院基础医学所提供。

1.2γ射线照射源

军事医学科学院放射医学所⁶⁰Co源，吸收剂量率168.5c Gy/min。

1.3主要试剂

兔抗鼠HSV-tk多抗LotB由美国耶鲁大学Summers.W教授惠赠；DNA提取试剂盒DNAzol、RNA提取试剂盒Trizol为GIBCO产品；PCR产物回收试剂盒(Advantage^R PCR-Pure Kit）为Clontech产品； GCV为Warner-Lambert产品;PCR引物参见文献［1］; HMB45、S100单克隆抗体、SP组化试剂盒及DAB显色剂购自福州迈新公司。

1.4离体实验

1.4.1逆转录病毒转染B16细胞

按文献［1］方法进行。

1.4.2hytk基因整合及表达的鉴定

1.4.2.1PCR分析hytk基因的整合：按DNAzol说明书提取细胞基因组DNA，取1 μl DNA用于PCR扩增，50 μl体系, 94℃预变性1 min，加Taq酶2 U，94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环后72℃延伸7 min，2%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.2.2RNA Dot blotting检测hytk的mRNA表达：按Advantage^RPCR-Pure Kit说明书回收530 bp的hytk基因PCR产物，缺口平移法［α-³²P］dATP标记PCR产物作探针。按Trizol说明书提取细胞总RNA，按文献［2］进行RNA Dot blotting。

1.4.2.3免疫组织化学检测HSV-tk蛋白表达：按文献［1］进行。

1.4.3MTT法检测B16/HyTK细胞对GCV的体外敏感性

参照文献［1］进行。

1.4.4⁶⁰Co和GCV对转hytk基因细胞的协同效应

将对数生长期的B16细胞和B16/HyTK细胞制备成单细胞悬液，分为B16，B16/HyTK，B16/HyTK+GCV 3组，低剂量GCV选用0.02 μg/ml，根据MTT法检测出的GCV起效时间设定加药时间。分别照射0，2，4，6，8，10 Gy后不同浓度接种60 mm培养皿，2周后甲醛固定，Giemsa染色，光镜下计数大于50个细胞以上的克隆。按文献［4］方法分别计算接种效率及存活分数。

微机按多靶单击模型（multi target single hit survival model）拟合数据^［3］，绘出细胞存活曲线。计算射线增敏率（sensitizer enhancement ratio，SER）为两组细胞间D₀值的比。

1.5体内实验

1.5.1荷瘤小鼠模型的建立及鉴定

取生长良好的B16/HyTK细胞，以5×10⁷ /ml悬浮于PBS中,小鼠右腋下皮下接种0.2 ml即1×10⁷细胞，复制黑色素瘤模型，1周后取瘤块石腊包埋，5 μm厚连续切片，分别行HE染色和采用SP免疫组化法检测HMB45，S100和HSV-tk蛋白表达。

1.5.2HSV-tk/GCV在体治疗的疗效观察

取10只C57BL/6小鼠，复制转hytk基因黑色素瘤模型，接种1周后随机等分。一组给予GCV腹腔注射，剂量为60 mg·kg^-1.d^-1，分2次给药，连续7 d；另一组同法注射PBS；均于第9天处死小鼠后取瘤块，游标卡尺测瘤体长短径（A，B）并计算肿瘤体积，体积(mm³)=0.5236×AB²/2^［4］；制备石蜡切片，HE染色后封片镜检。

1.5.3单纯γ射线照射下B16/HyTK细胞在小鼠体内的生长情况

C57BL/6小鼠后足背皮下接种10⁸/ml B16/HyTK细胞0.05 ml，2周后成瘤，将小鼠随机分为B16/HyTK, B16/HyTK+5 Gy, B16/HyTK+10 Gy, B16/HyTK+20 Gy等 4组，每组8只，照射荷瘤肢。隔日测瘤体长短径，绘出其生长曲线。

1.5.4⁶⁰Co和GCV对转HytK基因细胞的体内协同作用

根据单纯γ射线照射下B16/HyTK细胞在C57BL/6小鼠体内的生长情况，选择一适当的照射剂量，同时给予腹腔注射GCV；单纯GCV腹腔注射组作为对照。 低剂量GCV的用法参考文献［5］，观察肿瘤生长情况。

1.6计算及统计

细胞剂量存活曲线计算机处理程序(version2.1)由军事医学科学院提供，有关统计过程均在SPSS9.0统计软件中进行，以P＜0.05为显著性水平。

2结果

2.1hytk 基因的转染

用PA317/HyTK病毒上清转染的C16细胞，经潮霉素（400 μg/ml）加压筛选3周，获得抗性克隆，命名为B16/HyTK，培养传代。

2.2PCR分析hytk基因的整合

PCR特异性扩增出530 bp的hytk 基因片段。证实有hytk基因的插入。

2.3Dot blotting检测目的基因的表达

Dot blotting结果证实B16/HyTK细胞中有hytk 的 mRNA表达。

2.4免疫组织化学检测HSV-tk蛋白表达

B16/HyTK细胞的胞浆可见棕褐色的阳性染色，而野生型B16细胞未见阳性染色。

2.5GCV对B16/HyTK细胞的体外杀伤作用

GCV对B16/HyTK细胞有明显的杀伤作用。其IC₅₀值为1.874 μg/ml，而对野生型B16细胞无明显毒性（P＜0.05）。其作用起效时间为48 h，120 h可杀伤绝大部分转基因细胞。

2.6⁶⁰Co和GCV对转hytk基因细胞的协同效应

①不同剂量照射后B16/HyTK细胞与野生型B16细胞的存活曲线无明显差异（P＞0.05）；②B16/HyTK组的D₀值为3.095，B16/HyTK+GCV组的D₀值1.911，SER为1.62。

2.7荷瘤小鼠模型的建立及鉴定

免疫组化染色可见HMB45及S100蛋白表达，说明肿瘤恶性黑色素瘤来源性未变；HSV-tk蛋白表达阳性说明肿瘤接种小鼠后其转入的治疗基因表达良好。

2.8HSV-tk/GCV在体治疗疗效观察