摘要目的： 通过转染HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90于4株人消化系肿瘤细胞系，以建立HSP90β蛋白低调肿瘤细胞系, 并研究HSP90β蛋白低调后细胞的生长情况。方法： 用Lipofectamine介导将pcDNA-HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901、人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402及人食道癌细胞系Ec109，用G418进行筛选，用RNA酶保护分析法鉴定HSP90β反义核酸的表达，用 Western blot 法检测HSP90β蛋白的表达。用细胞生长曲线研究基因转染细胞的生长情况。结果： pcDNA-HSP90转染细胞AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109有HSP90β反义RNA表达, 这些细胞HSP90β蛋白表达低调。研究还发现这些细胞的生长受到不同程度的抑制，其中AH-SGC7901/VCR及AH-Ec109细胞受抑程度更明显。结论： pcDNA-HSP90转染细胞AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109 HSP90β蛋白表达降低，细胞的生长受到不同程度的抑制。

《中国图书资料分类法》分类号Q78

Construction of HSP90β Protein Down-Regulated Tumor Cell Lines

Liu XianlingXu LiGuo JianchengXiao BingYu ZhaocaiFan Daiming

（Institute of Digestive Disease, XiJing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032）

AbstractObjective： To set up HSP90β Protein down-regulated digestive tumor cell lines and study the influence of HSP90β to tumor cells. Methods: pcDNA-HSP90 of HSP90β anti-sense RNA reconstructs was transfected into SGC7901 of human gastric cancer cell line, SGC7901/VCR of MDR-type human gastric cancer cell line, HCC7402 of human hepatic cancer cell line and Ec109 of human esophageal cancer cell line by lipofectamine. Positive clones were selected by G418. Antisense RNA of HSP90β of the positive clones was detected by RNase protection assay and the expression of HSP90β protein was assayed by Western blot. Cell growth was studied by cell growth curve. Results: pcDNA-HSP90 transfected cells were named AH-SGC7901, AH-SGC7901/VCR, AH-HCC7402 and AH-Ec109 respectively and there were antisense RNA of HSP90β in them. HSP90β protein in them was lower than in their parental cells. Cell growth was inhibited to different degrees, and the growth of AH-SGC7901/VCR and AH-Ec109 cells were most greatly inhibited. Conclusion: The expression of HSP90β protein in AH-SGC7901, AH-SGC7901/VCR, AH-HCC7402 and AH-Ec109 cell lines was decreased and the study also showed that decreasing the expression of HSP90β could inhibit tumor cell growth.

Key wordsHSP90β； anti-sense RNA； gene transfection； RNase protection assay； Western blot

近年来,发现HSP90与肿瘤的关系比较密切^［1～3］。HSP90α可通过调节细胞周期促进细胞增殖，HSP90β能够抑制细胞凋亡与分化^［4，5］，且最近有人报道HSP90β与P-gp的表达有关^［6］。本研究拟用HSP90β反义核酸转染人4株消化系肿瘤细胞系，以建立HSP90β蛋白低调细胞系, 为进一步研究HSP90β对肿瘤细胞的生物学意义提供实验材料，并研究HSP90β蛋白对消化系肿瘤细胞生长的影响。

1材料与方法

1.1材料

人胃癌细胞系SGC7901, 人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR, 人肝癌细胞系HCC7402, 人食道癌细胞系Ec109。HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90由刘宪玲等^［7］构建。 pcDNA 3.1(+)由美国扬静华提供。主要试剂（略）。

1.2方法

1.2.1重组质粒的转染及阳性克隆的筛选

实验组转染pcDNA-HSP90, 空载体对照组转染pcDNA3.1(+), SGC7901，SGC7901/VCR，HCC7402，Ec109细胞作为相应的空白对照组。碱裂解法提取重组质粒pcDNA-HSP90。用Lipofectamine介导基因的转染（按说明书进行），G418（400 μg/ml）进行抗性筛选。3～4周后见抗性细胞集落形成，挑选细胞克隆，用含100 μg/ml G418的10%FBS-PRMI 1640液扩大培养。

1.2.2RNA酶保护分析法检测基因转染细胞HSP90反义核酸的表达^［9］

从HSP90β cDNA序列的第1 641 bp起，读取30个bp作为探针，送上海生物工程公司合成。末端标记法标记寡核苷酸探针^［8］。提取RNA同时做含量测定后，取RNA 10 μg, 加1.0×10⁵ cpm的［γ-³²P］标记的寡核苷酸探针及β-actin探针，加无水乙醇、糖原、3 mol/L 乙酸钠，于-20℃放置20 min，离心、乙醇洗涤、真空干燥，加30 μl甲酰胺杂交缓冲液重悬；85℃ 变性5～10 min，37℃杂交过夜。 加RNase S1 buffer 2 μl, 水16 μl, RNase S1 2 μl（2 μg/ml）, 37℃消化1 h；乙醇沉淀；加20 μl终止液（10%SDS, 20 mg/ml 蛋白酶κ）37℃ 15 min；酚/氯仿抽提、乙醇沉淀、真空干燥；重溶于10 μl RNA 上样缓冲液中，上样，做18%聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳（200 v, 120 min）和放射自显影。

1.2.3Western blot检测基因转染细胞HSP90β蛋白的表达

用三去污剂裂解缓冲液裂解细胞，获取细胞裂解液经蛋白质定量后行SDS-PAGE，电转膜及免疫印迹。山羊抗人HSP90β一抗（1∶100）室温作用2 h；辣根过氧化酶标记的驴抗山羊IgG（1∶500）室温作用1 h；PBS洗涤，四氯萘酚显色并拍照。用Quantimet 570 (Germany, Leica Inc.) 图象分析仪（QUIC图象系统）对免疫印迹结果进行半定量分析。条带的染色强度以灰度值表示（256级灰度，条带越深，灰度值越小）。

1.2．4转染细胞的形态和生长速度观察

分别取基因转染细胞及其相应的亲本细胞（细胞浓度为1×10⁴/孔，每孔2 ml体积）接种于24孔板，常规培养，观察细胞形态及生长状况，绘制细胞生长曲线。并按Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间。Td = T*lg2/lg（N_t/N₀）。其中Td为细胞倍增时间（h），T为细胞由N₀增至N_t所需时间（h）。

2结果

2.1G418筛选出的阳性克隆

pcDNA-HSP90转染SGC7901，SGC7901/VCR，HCC-7402及Ec109细胞后，筛选出其相应的阳性克隆，被分别命名为AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC74O2及AH-Ec109。空载体pcDNA转染细胞被命名为SGC7901-pcDNA，SGC7901/VCR-pcDNA，HCC7402-pcDNA及Ec109-pcDNA。

2.2RNA酶保护分析法结果见图1。

图1RNA酶保护分析法检测HSP90反义RNA转染细胞、空载体转染细胞

及其亲本细胞中HSP90反义RNA的表达

Fig. 1The expression of anti-sense RNA of HSP90 in pcDNA-HSP90 transfected cell lines, pcDNA transfected

cell lines and their parental cell lines by RNase protection assay

M: PBR322 DNA/HaeⅢ Marker； C₁: Positive control，β-actin(20 bp) and HSP90 probe (30 bp)； C₂: Negative control, probe plus

RNase S1, no RNA. 1: AH-SGC7901/VCR; 2: SGC7901-pcDNA/VCR; 3: SGC7901/VCR; 4: AH-SGC7901; 5: SGC7901-pcDAN;

6: SGC7901; 7: AH-HCC7402; 8: HCC7402-pcDNA; 9: HCC7402; 10: AH-Ec109; 11: Ec109-pcDNA; 12: Ec109

HSP90β反义核酸转染细胞AH-SGC7901/VCR（1），AH-SGC7901（4），AH-HCC7402（7）及AH-Ec109（10）组有两条电泳带，依据分子量Marker，可确定它们分别为β-actin内参照及HSP90 反义RNA；转染pcDNA3.1(+)组及空白对照组可见1条带为β-actin。表明pcDNA-HSP90已转染入细胞，并有HSP90β反义RNA的表达。

2.3HSP90β反义核酸转染细胞HSP90β蛋白低调

Western blot 结果见图2。用Quanuimet 570 图象分析仪进行分析，结果见表1。

pcDNA-HSP90转染细胞系HSP90β蛋白的表达明显低于其亲本细胞系及其空白对照细胞系。

图2pcDNA-HSP90转染细胞HSP90β蛋白的表达

Fig. 2The expression of HSP90β protein in pcDNA-HSP90 transfected cell lines

1： SGC7901； 2： SGC7901-pcDNA； 3：AH-SGC7901； 4： SGC7901/VCR； 5： SGC7901/VCR-pcDNA；

6： AH-SGC7901/VCR； 7： HCC7402