摘要目的： 探讨腺病毒介导的p53与p16基因联合对人肺腺癌GLC-82疗效提高的可能性。方法： 将分别携有p53基因、p16基因重组腺病毒(Ad-p53与Ad-p16)联合使用，通过细胞生长和存活实验、克隆形成实验、流式细胞分析、TUNEL检测、RT-PCR分析、免疫组织化学实验，观察其对人肺腺癌GLC-82细胞的作用。结果： 在总感染强度相同的前提下，Ad-p53与Ad-p16联合导入GLC-82细胞，对细胞生长存活及克隆形成能力的抑制、以及所造成的凋亡效果比施用单种基因的效果强，表明p53基因与p16基因在体外疗效上互为协同。结论： Ad-p53与Ad-p16联合，可以提高对人肺腺癌GLC-82细胞的疗效。

《中国图书资料分类法》分类号R730.5； R734.2

The Experimental Studies of Ad-p53 and Ad-p16 in Combination on Human Lung Adenocarcinoma Cell Line GLC-82

Xu MinyiLin ChenLiang XiaoFu MingZhang XueyanWu Min

(National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021)

AbstractObjective: To determine the effect of Ad-53 and Ad-16 both alone and in combination on the growth of human lung adeuocarcinoma cell line GLC-82. Methods: Human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 were trasferredvia an adenovirus-mediated p53 gene (Ad-p53), P16 gene Ad-p16 or both. Cell growth inhibition assay, colony formation, flow cytometry assay, TUNEL, RT-PCR and immunhistochemistry assays were used to evaluate the therapeutic efficiency of such strategy on trasferred cells. Results: in vitro experiments, at the same dose of Ad (multiplicity of infection), simultaneous transfer of Ad-p53 and Ad-p16 to GLC-82 cells caused stronger therapeutic efficacy than caused by single kind of Ad transfer, demonstrating that Ad-p53 treatment has synergistic efficacy with Ad-p16 treatment on GLC-82 cells. Conclusion: Ad-p53 for GLC-82 cells shows enhanced therapeutic efficiency when combined with Ad-p16.

Key wordscancer gene therapy; combined therapy; lung adeuocarcinoma

肿瘤基因的优势在于它通过改变肿瘤最根本的分子基础而抑制肿瘤的发生和发展。截至1998年12月，在美国进行的261个基因临床实验中，肿瘤治疗占159个^［1］。但目前肿瘤治疗的疗效并不理想，即使在实验动物中也难以完全抑制肿瘤的生长^［2］。通过不同治疗基因间的联合来提高疗效是一种新的尝试。治疗基因间的联合可通过两种方式：①将两个或两个以上的基因融合，由一个载体携带表达^［3］；②仍由由一个载体携带一个基因，联合使用携不同基因的同种载体^［4，5］。当不同种治疗基因联合后，可望提高疗效；或在保证疗效的同时，降低基因、载体的用量。为达到这些目的，也要求联合治疗的疗效超过单种(基因)治疗的疗效。但是，在采用第2种联合方式时，两者疗效的比较就要建立在两者所用基因的量(或载体的量)相同的前提上。这时，要想让联合治疗的疗效超过单种(基因)治疗的疗效，就必须使用在联合时各治疗基因的疗效互相协同，而非简单的加成。否则在载体载荷基因量相同的前提下，直接采用疗效最强的单个基因即可在疗效上胜过多基因联合的效果。

本实验采用腺病毒载体介导的p53基因与p16基因联合，通过一系列的体外实验，探讨联合治疗提高肿瘤治疗疗效的可能性。

1材料与方法

1.1材料

重组腺病毒Ad-LacZ, Ad-p53,Ad-p16为本室构建^［6］，分别携有细菌LacZ基因，野生型p53 cDNA (1.8 kb)，及野生型p16 cDNA(0.5 kb)。293细胞为腺病毒的E1基因转化的人胚肾细胞系，购自Micro-bix Biosystems公司。人肺腺癌细胞系GLC-82细胞，本室保存。RNA提取试剂盒(Trizal Reagent Kit)(Life Technologies)。TUNEL试剂盒(Boehringer Mannheim)。过氧化物酶标记的链霉卵蛋白(Streptavidin/Peroxidase SP)染色试剂盒(北京中山生物技术公司)。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1重组腺病毒繁殖、滴度测定、保存及感染

按文献［6］进行。

1.2.2细胞生长与存活的抑制实验、克隆形成实验、流式细胞仪分析

在同一个时间点消化收集各组细胞：2%台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞。每组3个样品，求平均值及标准差，并计算加药组对细胞生长的抑制率。克隆形成实验、流式细胞仪分析按文献［6］进行。

1.2.3TUNEL(末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记，TdT-mediated dUTP nick end labeling)检测

方法按试剂盒(Cat. No. 184817)的说明进行。

1.2.4分析及检测

RT-PCR分析按文献［7］进行。免疫组织化学检测按GP试剂盒的说明进行。

2结果

2.1联合Ad-p53与Ad-p16引起GLC-82肺腺癌细胞的形态学改变

Ad-p53，Ad-p16或两者联合处理GLC-82细胞4 d后，细胞变圆，有凋亡小体出现，随后细胞脱落且有大量凋亡小体脱离细胞(图1)。联合施用Ad-p53与Ad-p16时，所引起GLC-82细胞的凋亡形态学特征变化更为明显。

图1Ad(50MOI)处理GLC-82细胞4 d后相差显微镜下观察

Fig.1Phase-contrast photomicrographs of GLC-82 cells,

4 days after treatment with Ad (50MOI)

A： Ad-LacZ; B: Ad-p53; C: Ad-p16; D: Ad-p53+Ad-p16(各25MOI)

2.2联合Ad-p53与Ad-p16对GLC-82肺腺癌细胞生长的抑制

在生长抑制实验中选有代表意义的时间点进行检测。结果显示，Ad-p53与Ad-p16各25 MOI(multiplisity of infection)联合作用7 d，对GLC-82细胞的生长抑制率为56.6%(与单用Ad的效果相比，P＜0.007)，明显强于单用50 MOI的Ad-p53或Ad-p16的抑制效果(分别为40.7%, 38.2%，与对照组Ad-LacZ相比，P＜0.02)。表明Ad-p53与Ad-p16对GLC-82细胞的生长抑制作用互为协同。

2.3联合Ad-p53与Ad-p16对GLC-82肺腺癌细胞克隆形成能力的影响

在同等MOI(50)的前提下，联合施用Ad-p53和Ad-p16(各25 MOI)对GLC-82肺腺癌细胞的克隆形成抑制率为51.0%(与用单种Ad的效果相比，P＜0.04)，均高于被Ad-p53(50MOI)或Ad-p16(50 MOI)单独感染GLC-82细胞的抑制率(分别为32.3%,31.4%，与对照组Ad-LacZ相比P＜0.01)。这一结果表明，当p53基因和p16基因联合时，两基因在对GLC-82肺腺癌细胞克隆形成能力的抑制上具有协同作用。

2.4流式细胞仪分析

流式细胞仪检测分别感染Ad-p53，Ad-p16及Ad-p53+Ad-p16 6 d后的细胞结果表明，上述3种施“药”方式均能引起GLC-82肺腺癌细胞出现不同程度的凋亡峰(图2)。与单用Ad-LacZ，Ad-p53或Ad-p16所引起的凋亡峰相比(分别为4.3%，7.4%和5.7%)，联合施用Ad-p53与Ad-p16所引起的凋亡峰更为明显(20.9%)。表明p53基因和p16基因在诱导GLC-82肺腺癌细胞凋亡时互为协同作用。

2.5TUNEL实验检测细胞凋亡

TUNEL实验表明，未被Ad感染或被Ad-LacZ(50 MOI)感染的GLC-82细胞基本上未呈现绿色荧光或荧光极弱，经过底物反应后，细胞基本不着色，表明细胞很少发生凋亡。而被Ad-p53，Ad-p16(50 MOI)和Ad-p53+Ad-p16(各25 MOI)处理的GLC-82细胞均有明显的凋亡。而且Ad-p53与Ad-p16联合感染的细胞凋亡更为强烈，呈现绿色荧光的细胞数量、荧光强度均较单用组明显。

2.6Ad介导的p53，p16基因在GLC-82细胞中的表达

感染强度为50MOI的Ad处理后第2，4天分别提取各组细胞的总RNA进行RT-PCR。结果显示(图3A，3B)，Ad介导的p53,p16基因进入GLC-82细胞并有转录水平的表达。另外，感染Ad后第4天，目的基因转录水平的表达高于第2天的表达，显示p53或p16基因进入GLC-82细胞后，其表达具有时间依赖性。

采用免疫组化方法检测导入基因的蛋白表达水平同样表明，感染了Ad-p53和Ad-p16的细胞呈现棕褐色阳性结果，表明Ad所携的p53和p16基因进入GLC-82细胞中并表达。

图2流式细胞仪分析腺病毒处理的GLC-82细胞

Fig.2Flow cytometry analysis of GLC-82 cells treated with Ad

A： Untreated; B: 50 MOI Ad-LacZ; C: 50 MOI Ad-p1