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《中国图书资料分类法》分类号R73-362
Folkman等发现［1］实体肿瘤及其转移物的生长、维持必须有新生血管的形成。为了刺激血管形成，肿瘤分泌一系列细胞生长因子(aFGF和bFGF)等［2］。然而，奇怪的是许多恶性肿瘤还形成血管的抑制因子，如angiostatin［3］，糖蛋白G［4］。另一些血管抑制因子则与肿瘤无关，包括血小板因子4［5］，IFN-α，IFN诱导蛋白10［6］，gro-beta［7］，催乳素N端片断［8］。近来O'Reilly［9］继1994年从小鼠Lewis肿瘤细胞中分离出的38 kD具有肿瘤血管内皮细胞生长抑制作用的angiostatin后，又从小鼠血管内皮细胞瘤中分离到一种新的20 kD，且具有特异抑制血管内皮细胞生长的抑制因子Endostatin。该物质在小鼠中对肿瘤诱导的血管生成具有几乎完全的抑制作用，显示出很强的抗肿瘤活性。
1Endostatin的发现及特性
O'Reilly［9］等发现一种小鼠血管内皮瘤细胞系EOMA的培养基具有血管内皮细胞抑制作用。将该培养基过赖氨酸葡聚柱后，其抑制活性并不存在于结合物质，而在流穿部分中，表明该抑制活性不是由angiostatin引起。但如许多具有血管抑制剂的物质一样，具有该抑制活性对肝素sephrose有亲和力。经肝素亲和层析及S200凝胶过滤及几轮C4柱反相HPLC后，该活性物质纯化到单一电泳纯，从10 L含500 mg纯蛋白的培养基中纯化到2 μg的活性物质，抑制活性提高5 000倍，活性回收率为2%。该物质分子量为20 kD左右，在(100～600) ng/ml浓度对血管内皮细胞有剂量依赖的特异抑制生长作用，对其它细胞无作用。N端氨基酸序列测定结果表明，该物质为胶原ΧⅧ C未端片段，被命名为Endostatin。其核酸及推导的氨基酸序列如图1所示：
1 CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG CTC CAC CTG GTT GCG CTC AAC48
1 H S H R D F Q P V L H L V A L N16
49 AGC CCC CTG TCA GGC GGC ATG CGG GGC ATC CGC GGG GCC GAC TTC CAG96
17 S P L S G G M R G I R G A D F Q32
97 TGC TTC CAG CAG GCG CGG GCC GTG GGG CTG GCG GGC ACC TTC CGC GCC144
33 C F Q Q A R A V G L A G T F R A48
145 TTC CTG TCC TCG CGC CTG CAG GAC CTG TAC AGC ATC GTG CGC CGT GCC192
49 F L S S R L Q D L Y S I V R R A64
193 GAC CGC GCA GCC GTG CCC ATC GTC AAC CTC AAG GAC GAG CTG CTG TTT240
65 D R A A V P I V N L K D E L L F80
241 CCC AGC TGG GAG GCT CTG TTC TCA GGC TCT GAG GGT CCG CTG AAG CCC288
81 P S W E A L F S G S E G P L K P96
289 GGG GCA CGC ATC TTC TCC TTT GAC GGC AAG GAC GTC CTG AGG CAC CCC336
97 G A R I F S F D G K D V L R H P112
337 ACC TGG CCC CAG AAG AGC GTG TGG CAT GGC TCG GAC CCC AAC GGG CGC384
113 T W P Q K S V W H G S D P N G R128
385 AGG CTG ACC GAG AGC TAC TGT GAG ACG TGG CGG ACG GAG GCT CCC TCG432
129 R L T E S Y C E T W R T E A P S144
433 GCC ACG GGC CAG GCC TCC TCG CTG CTG GGG GGC AGG CTC CTG GGG CAG480
145 A T G Q A S S L L G G R L L G Q160
481 AGT GCC GCG AGC TGC CAT CAC GCC TAC ATC GTG CTC TGC ATT GAG AAC528
161 S A A S C H H A Y I V L C I E N176
529 AGC TTC ATG ACT GCC TCC AAG TAG 552
177 S F M T A S K * 184
图1Endostatin的核酸及氨基酸序列
2Endostatin的生物学特性
2.1Endostatin的产生及其结构特点
胶原ΧⅧ是1994 Rehn［10］鉴定出的一种新的非纤维性胶原，与胶原XⅤ同为胶原超家属的multiplexin亚组（multiple triple-helix domains and interruptions）。其结构特点是分三个部分，第一部分为N端大球形结构,中间部分是含有多个间隔序列的三股超螺旋（triple-helical）区，C端为含4个保守半胱氨酸的球形结构（其中含endostatin序列）。肝脏是重要的胶原XⅧ产生器官［11］。有二种形式的胶原ΧⅧ存在，一种N端区域为303个氨基酸（NC-303），另一种为493个氨基酸残基（NC-493）。分别为基底膜存在形式及血浆存在形式。Endostatin为分子量20 kD的胶原ΧⅧ C球形未端部分片段。小鼠的C未端结构含315个氨基酸，Endostatin是132～315肽段，结构见图2。
图2体内二种胶原蛋白ΧⅧ的结构及Endostatin位置
在体内，胶原ΧⅧ可以通过好几种蛋白水解途径产生Endostatin（22 kD）和/或全C未端结构蛋白（38 kD）及介于二者中间的蛋白。38 kD的全C片段对基底膜蛋白的亲和力要高于22 kD的Endostatin。在人体多种组织抽提物中含丰富的Endostatin样多肽，其分子量同全C未端蛋白，其中鼠肝100 mg组织中含2 μg该蛋白。健康人的血液中含各种类型的22 kD Endostatin样蛋白，免疫法测定为120～300 ng/ml，推测肌体组织中含有与基底膜蛋白结合的Endostatin池，蛋白的水解作用释放入血,血清中产生可溶性的Endostatin。此外，肝脏的疾病也影响胶原XⅧ及Endostatin的产生。
2.2Endostatin的血管生长抑制作用
O'Reilly证实大肠杆菌生产的复性、未复性的Endostatin及杆状病毒产生的重组Endostatin均有抑制鸡胚血管生成的作用（chick chorioallantoic membrane, CAM）。同样，酵母产生的Endostatin也证实存在同样的作用。Blezinger等［12］证实，直接肌肉内注射Endostatin表达质粒可以降低肿瘤血管形成3倍以上，可以抑制65%的实验性角膜新生血管诱导生长。
2.3Endostatin抑制血管内皮细胞增殖及诱导凋亡作用
Endostatin对牛毛细血管内皮细胞、牛肺主动脉内皮细胞有特异的抑制增殖作用，而对非血管内皮细胞系细胞如NIH3T3，A10平滑肌细胞等则无增殖抑制作用。这种抑制作用在含血管形成促进因子bFGF（3 ng/ml）时更为明显。该生长抑制作用与细胞的凋亡相伴随［13］。牛肺主动脉内皮细胞经Endostatin（10 μg/ml）作用后，细胞变圆，并与基质相脱离。细胞凋亡的早期表现为12 h后annexinV-FLFC结合试验中磷脂酰丝氨酸(PS)由细胞膜内侧面转位至细胞膜外侧，24 h后细胞内的半胱天冬酶活性明显增加。TUNEL法也测到核内DNA的降解，同时细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL含量也下降。
2.4Endostatin的抗肿瘤作用
O'Reilly证实了Endostatin对肿瘤的转移和原发性种植肿瘤具有抑制作用。当给予小鼠0.3 mg/kg/d 皮下注射时，小鼠Lewis肺癌的转移几乎完全被抑制。重组的复性或非复性的Endostatin在小鼠中几乎完全抑制种植已达100～200 mm3大小的Lewis肺癌、T241纤维肉瘤、Eoma血管内皮细胞瘤、B16F10黑色素瘤的生长，原发性肿瘤消退至显微镜可见的休眠期。免疫组化证实肿瘤血管形成被阻断，肿瘤细胞的凋亡指数提高7倍。在Endostatin的治疗中没有发现任何毒副作用。
更有意思的是Folkman［14］实验室的Endostatin抗肿瘤实验结果。用Endostatin治疗小鼠Lewis肺癌后，肿瘤缩小，停止给药后，肿瘤又回复到原来大小；再用Endostatin治疗，肿瘤再次缩小，这样持续6轮循环治疗后，Endostatin治疗仍然有效，而且肿瘤在被观察的5个月内未再复发。这一实验
