摘要目的: 探索靶向性非病毒载体系统在人脑胶质瘤基因治疗中的应用。方法: 组建了EGF-R介导的GE7基因转移系统，分别与β-gal报道基因和p21基因构成载体复合物，体外转染U251细胞，通过X-gal染色、Western blot分析、原位末端标记、DNA梯带检测等，观察了外源基因的导入及对肿瘤细胞的抑制作用。结果: X-gal染色表明，外源基因的导入率可达80%；转染p21基因后，细胞生长受到明显抑制，第7天生长抑制率约58%。原位末端标记及DNA梯带检测发现，转染细胞有明显的凋亡发生。结论: GE7载体系统能高效靶向地将外源基因导入肿瘤细胞，外源基因的表达可明显抑制肿瘤细胞的生长，有效诱导其凋亡。

《中国图书资料分类法》分类号R735.7

In vitro Inhibitory Effect on Growth of Human Glioma Cells with p21 Gene Mediated by a Novel Gene Delivery System

Liuxiang, Han Junsong, Tian Peikun, Gu Jianren

(National Laboratory for Oncogenes & Related Genes, Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032)

AbstractObjective: To investigate the effects of novel targeted non-viral vector in gene therapy of human glioma. Methods: The EGF-R targeting gene delivery system GE7 was constructed. Human glioma cell line U251 was transfected in vitro with β-gal as reportor gene and p21 as therapeutic gene using this gene delivery system. By means of the assay of β-galactosidase staining, Western blotting, in situ end labeling apoptosis cells and DNA ladder, the transferring of exogenous genes and the apoptosis of the tumor cells were examined. Results: It was showed that gene transfer efficiency is over 80%. When transfected with p21 gene, the growth of cells was inhibited significantly, and the apoptosis was detected in the transfected cell by the methods of in situ end labeling and DNA ladder. Conclusion: The GE7 gene delivery system has the ability to transfer exogenous gene to tumor cells and the expression of the therapeutic gene can inhibit the growth of the cells.

Key wordsEGF-Receptor; glioma; targeted non-viral vector; p21^WAF-1; apoptosis

脑胶质瘤是神经系统中发病率最高的肿瘤，由于肿瘤呈浸润性生长，手术难以探到功能区和脑深部，病人复发率高。寻找有效的治疗方案是脑恶性胶母细胞瘤的重要课题。尽管近年对应用免疫疗法和细胞因子等基因治疗给予了一定评价，但恶性脑胶质瘤病人总的预后没有明显改善。为克服目前基因治疗存在的载体系统效率低下，无靶向性的缺点，针对脑胶质瘤细胞多伴有表皮生长因子受体（EGF-R）的过度表达^［1］，本研究室组建了GE7受体介导的靶向性非病毒载体系统，以p21作为肿瘤细胞凋亡的诱导基因，构成转移复合体，经体外实验观察并证实了载体系统介导的肿瘤抑制效应。此项工作有可能为今后部分脑胶质瘤的治疗开辟一条新途径。

1材料与方法

1.1主要试剂

硫氰酸胍（SPDP）为Serva产品。二硫苏糖醇（DTT）、X-gal、多聚赖氨酸(Polylysine MW29 000)均为Sigma产品。In Situ Cell Death Detection Kit (AP) 购于Boehrngerg 公司。抗人p21抗体购于Oncogene 公司。DAB染色试剂盒购于华美生物工程公司。

1.2菌株、质粒和细胞

E.coli DH5α由本室保存。pCEP-β-gal, pCEP由本室构建，pCEP-21由Dr. Bert Vogelstein惠赠。U251人脑胶质瘤细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。DMEM为GIBCO产品。

1.3基因导入系统的构建^［2］

1.3.1根据EGF功能域设计的GE7 16肽及流感病毒血凝素N端20肽HA20由本实验室合成。

1.3.2GE7-Polylysine，HA20-Polylysine的合成

GE7，HA20，Polylysine与SPDP分别按1∶5的摩尔比，25℃反应2 h。Polylysine-PDP溶液与过量DTT反应。巯基化的Polylysine以1∶3摩尔比，分别与GE7-PDP, HA20-PDP在25℃反应24 h，反应完毕后产物透析、干燥。

1.3.3多肽/DNA四元复合体的制备

调整pCEP-β-gal，pCEP及pCEP-21 3种DNA的浓度为0.2 μg/μl。将GE7-Polylysine与HA20-Polylysine等量混合，以1∶1的质量比缓慢加至DNA溶液中，25℃反应30 min，1%琼脂糖凝胶电泳观察DNA阻滞情况。

1.4β-gal基因导入实验

U251人脑胶质瘤细胞按2×10⁴/孔密度接种6孔板。去培养液，加入含GE7-POLY/β-gal/POLY-HA20复合体的转染液，其中DNA的浓度2 μg/ml DMEM，37℃,5%CO₂培养，24 h后更换完全培液，之后每24 h检测细胞β-gal基因的表达情况。对照组分别为单纯DNA组及PBS组。

1.5β-gal组织化学染色^［3］

转染后的细胞用PBS(pH7.4)洗2次，甲醛-戊二醛4℃固定15 min，PBS（pH7.4）洗3次。加入X-gal反应液(5 mmol/L铁氰化钾、5 mmol/L亚铁氰化钾、2 mmol/L MgCl₂、1 mg/ml X-gal)，37℃反应过夜。光镜下观察变蓝细胞数，不同视野观察计算导入率。

1.6p21基因有效实验

消化细胞，以1.5×10³/孔的细胞密度接种96孔板。细胞分4组：GE7-POLY-HA20组、GE7-POLY/pCEP/POLY-HA20组、GE7-POLY/pCEP-21/POLY-HA20组及对照组。待细胞满度达40%～50%，更换成含相应复合体的转染液，每组DNA的终浓度为2 μg/ml，对照组以PBS代替，24 h后去转染液。

1.6.1Western blot 检测p21的表达

操作按文献［4］进行。收集转染72～96 h的细胞，转膜后的蛋白经封闭，预杂交、杂交后用DAB显色，蛋白分子量Maker用氨基黑染色。

1.6.2细胞生长曲线的观察

每24 h胰酶消化细胞,台盼蓝染色计数活细胞数目，每个样本3孔，每孔计数3次，取平均值作生长曲线。

1.6.3DNA电泳梯带检测

收集转染96 h的细胞，培养细胞DNA的抽提参照Molecular cloning^［4］。纯化后的DNA于1.5%的琼脂糖凝胶中电泳3 h。

1.6.4原位末端标记凋亡细胞

细胞转染96 h，凋亡检测按In Situ Cell Death Detection Kit (AP) 程序操作。

1.7统计学处理

所有资料均使用SPSS软件进行One-way方差分析，两组之间比较采用t检验。

2结果

2.1GE7，HA20-Polylysine共价连接物与DNA在低离子强度，近中性pH值条件下，可以通过静电作用形成复合体，以1∶1比例将两者混合反应后，1%琼脂糖凝胶电泳阻抑实验证实复合体的形成。图1可见，对照DNA在电泳中呈正常泳动行为，而与多肽反应的DNA则由于复合体的形成被完全阻滞在点样孔中。

图1DNA阻滞电泳结果

Fig. 1DNA retardation of 4-element complex

1:λDNA/HindⅢ Maker; 2: Plasmid DNA; 3:GE7/Poly-lysine/

HA20/pCEP-β-gal; 4: GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP-21;

5: GE7/Poly-lysine/HA20/pCEP

2.2基因导入实验

体外培养的人脑胶质瘤细胞U251经GE7-POLY/β-gal/POLY-HA20四元复合物转染，X-gal染色表明，转染24 h的细胞即有少量外源基因的表达，72～96 h达高峰，第7天后基本消失。而单纯DNA和PBS组则未见外源基因的导入(见图2)。

2.3p21基因有效实验

2.3.1p21基因在U251细胞中的表达

收集转染96 h的U251细胞，与抗人p21单克隆抗体进行Western blot 检测，结果显示，在约21 kD处有一明显条带，而对照组则无此表达条带(图3)。

2.3.2U251细胞生长曲线观察

GE7-p21四元复合物转染U251细胞，不同时间消化细胞计数。由细胞生长曲线可以看出，与3组对照组相比，p21转染组细胞生长缓慢，第7天抑制率为58%，表明p21对肿瘤细胞的生长有显著的抑制效应（图4）。

图2β-半乳糖苷酶染色分析

Fig. 2β-galactosidase assay in vitro

1: Human glioma cell U