摘要目的： 探讨分叉双歧杆菌的完整肽聚糖对巨噬细胞功能的调节作用。方法： 以完整肽聚糖注射于裸鼠腹腔，用小鼠胸腺细胞增殖法、L929细胞体外杀伤法及Griess试剂分别测定裸鼠腹腔巨噬细胞产生的IL-1,TNF-α及NO的水平；同时也观察了巨噬细胞体外杀瘤活性的变化。结果： 完整肽聚糖注射组裸鼠腹腔巨噬细胞产生的IL-1, TNF-α及NO含量均显著高于对照组，体外杀瘤活性也明显增强(P＜0.01)。结论： 分叉双歧杆菌的完整肽聚糖能激活巨噬细胞，增强其杀瘤活性，并使之分泌多量的细胞毒性效应分子。

《中国图书资料分类法》分类号R73-362

The Effect of Whole Peptidoglycan of Bifidobacterium on Cytokines and Cytotoxity Activity Derived from Peritoneal Macrophages of Nude Mice

Wang Lisheng,Pan Linjia, Shi Li, Li Mingsong, Sun Yong, Zhang Yali, Zhou Dianyuan

(PLA Institute for Digestive Medicine, Nan Fan Hospital, the First Military Medical Univisity, Guangzhou 510515)

AbstractObjective： To explore the adjustment of whole peptidoglycans of bifidobacteria to macrophage functions.Methods： The level of interleukin 1， tumor necrosis factor α and nitric oxide (NO) produced by peritoneal macrophages of nude mice was detected by employing mouse thymocyte proliferation method killing L929 cell method in vitro and Griess reagent,after whole peptidoglycans were injected into the nude mice peritoneally. Simultaneously, tumoricidal activity of the macrophages in vitro was observed.Results： The content of interleukin 1， tumor necrosis factor α and nitric oxide (NO) secreted from peritoneal macrophages of nude mice was significantly higher in the whole peptidoglycan group when compared with the control group. Futhermore, the tumoricidal activity of the macrophages in vitro was markedly promoted (P＜0.01).Conclusion： Whole peptidoglycans of bifidobacteria bifidum could activated macrophages to secrete a lot of cytotoxicity effectors,and elevate its tumoricidal activity.

Key words bifidobacterium; whole peptidoglycan; macrophage; cytokine; nitric oxide

很多微生物及其成份能激活机体免疫系统中的巨噬细胞，使之分泌多种一定量的细胞因子及重要介质，如BCG,OK-432,LPS及短小棒状杆菌等。双歧杆菌是人体及其它动物肠道内终生定植的生理性有益菌。完整肽多糖(whole peptidoglycan,WPG)是双歧杆菌细胞壁中的最主要成份，它能激活巨噬细胞，NK细胞及其它免疫效应细胞^［1］。本文检测了分叉双歧杆菌的WPG刺激裸鼠腹腔巨噬细胞后分泌的IL-1,TNF-α活性及NO的含量，同时也观察了巨噬细胞杀瘤活性的变化，旨在探讨激活的巨噬细胞在介导WPG多种重要生理功能中的作用。

1材料与方法

1.1WPG

按Sekine介绍的方法从分叉双歧杆菌细胞壁中提取而成^［2］，由重庆医科大学检验系胡宏教授惠赠。将分叉双歧杆菌接种于BL肉汤，37℃厌氧培养72 h后，收集细菌，以Triton X-100处理加热过的死菌，高速离心分离不可溶残渣，经蛋白酶Ε、胃蛋白酶、α糜蛋白酶、胰酶以及核酸酶消化，甲醇与氯仿脱脂，最后不可溶的提取物经0.01 N H₂SO₄处理，双蒸水透析后得到精制的WPG。同时分析了WPG的化学组份以及氨基酸组份，并以扫描电镜观察了它的超微结构。

1.2实验动物

BALB/c（nu/nu），6～8周龄，雌雄各半，体重18～23 g，购于本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。

1.3实验分组及WPG的处理措施

实验动物分两组。① WPG注射组：10只裸小鼠，于实验的第1天向裸鼠腹腔注射10%硫乙醇酸盐肉汤2 ml，第2天起腹腔注射WPG 0.25 mg（相当于1×10⁹个双歧杆菌，使用时溶于PBS液），每天1次，连续5 d；② 对照组：动物数量及第1天的处理措施均同WPG注射组，不同之处为第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 ml，每天1次，连续5 d。

1.4裸鼠腹腔巨噬细胞的收集及培养

于实验的第7天处死全部动物，常规消毒裸鼠腹部皮肤，以冷的D-Hank′s液灌洗腹腔，洗出液1 000 r/min 离心10 min，去上清，沉渣以无血清RPMI 1640培养液重悬2次，调细胞数为1×10⁶/ml，吸取100 μl细胞悬液加至96孔细胞培养板中，置37℃, 5%CO₂孵育箱中培养2 h，洗去未贴壁细胞，再加含10%小牛血清的RPMI 1640培养液及LPS(终浓度为10 ng/ml）继续培养，诱导24 h后收集孔内上清，置-30℃保存。

1.5IL-1活性的测定

采用小鼠胸腺细胞增殖法。无菌取出C₃H/HeJ小鼠胸腺，研磨过筛，制成浓度为1×10⁷/ml的单细胞悬液，内含1 μg/ml的Con A(Sigma产品)，吸取细胞悬液加至96孔细胞培养板中，100 μl/孔，然后分别加入待测上清，每孔100 μl，并设阴性对照，培养液对照及Con A对照，每份样品设3复孔,置37℃，5%CO₂孵箱中孵育72 h，最后4 h每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml),继续培养4 h，吸弃每孔上清180 μl，再加入100 μl二甲亚砜，振荡5 min，于Bio-Rad 550型酶标仪上读取波长为490 nm处的吸光值(A值)。

1.6TNF-α活性的测定

采用L929细胞体外杀伤法，具体操作步骤为：① 收集对数生长期的靶细胞L929，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调细胞浓度为2×10⁵/ml；② 将待测上清按不同稀释度(2倍稀释)加于96孔细胞培养板中，100 μl/孔，每一样品设3复孔；③ 每孔加入L929细胞悬液100 μl，同时设空白对照组及单独细胞对照组；④ 37℃，5%CO₂孵箱中培养24 h，用生理盐水洗涤细胞3次；⑤ 每孔加入0.5%中性红染色液200 μl，37℃培养1 h使活细胞充分着色；⑥ 以生理盐水冲洗2次，扣干，每孔加入脱色液(0.1 mmol/L Na₂HPO₄和90%乙醇等量混合液)200 μl，静置5 min；⑦ 于酶标仪上读取波长为530 nm处的吸光值(A值)。结果判断：将能导致细胞死亡50%的最大稀释倍数定为U/ml。细胞死亡率按公式计:

1.7Griess试剂

以蒸馏水配制0.1%盐酸萘乙二胺(Sigma产品)，5%磷酸配制1%磺胺嘧啶(Sigma产品)。临用前两者等量混合即可。

1.8NO₂标准曲线的制备

将1 mmol/L的NaNO₂ 对倍稀释后，加入等体积的Griess试剂。室温下轻轻摇振10 min，于Bio-Rad 550型酶标仪上读取波长550 nm处的 A值，每一样品设3个复孔，取其平均值。

1.9NO水平的测定

取待测上清100 μl，加入 30%硫酸锌5 μl去除蛋白质，5 000 r/min 离心10 min，收集其上清，与等体积的Griess试剂混合。室温下轻轻摇振10 min，于酶标仪上读取波长550 nm的吸光值(A值)。

1.10巨噬细胞杀伤活性的检测

以L1210细胞为靶细胞，用MTT间接比色法检测^［3］。收集处于对数生长期的L1210细胞，经Hank′s液洗后，用RPMI 1640完全培养基配成1×10⁵/ml备用；在96孔板中，加入1×10⁶/ml巨噬细胞100 μl/孔，2 h后洗去非贴壁细胞，再加入L1210细胞100 μl/孔，效靶比为10∶1，每一样品设3复孔，同时设L1210细胞对照。于37℃作用24 h后，振荡培养板使L1210细胞充分悬浮，每孔吸取100 μl的L1210细胞于另一96孔板中，加入20 μl/孔MTT(5 mg/ml),继续培养4 h后，加入10% SDS 100 μl，6～8 h后于酶联仪上测570 nm的吸光值(A值)。按下式计算杀伤活性：

1.11统计学处理

所得结果采用t检验。

2结果

2.1WPG对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1及TNF-α的影响

以小鼠胸腺细胞增殖法及L929细胞体外杀伤法分别检测IL-1及TNF-α的活性，结果显示WPG注射组裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1及TNF-α的活性显著高于对照组，均具有显著的统计学意义（P＜0.01），具体见表1。

2.2WPG对裸鼠腹腔巨噬细胞产生NO及细胞毒活性的影响

将一系列不同浓度的NaNO₂标准品与测定的对应A值作一标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程为Y＝0.013+0.022X，r=0.999，将不同标本测得的A值代入该直线回归方程中，即得到相应的NO含量。经统计学处理发现，WPG注射组的裸鼠腹腔巨噬细胞产生NO的量显著<