摘要目的： 探讨维甲酸在预防和治疗肿瘤中的作用机制，分离受维甲酸调控的靶基因。方法： 采用AP-PCR、测序、Northern杂交及序列同源分析等方法。结果： 首次发现ATRA可上调线粒体基因ATP酶第六亚单位表达， 这种表达上调开始于ATRA诱导早期并持续整个诱导过程(7 d）。Northern杂交结果证实了ATRA对线粒体基因ATP酶第六亚单位的上调作用。对线粒体基因组的转录调控区D-loop序列进行了初步分析发现，该转录调控区两处存在着与维甲酸受体反应元件核心序列高度一致的外翻重复序列（everted repeated sequences），其间隔分别为12 bp和13 bp。结论： 维甲酸受体与线粒体基因组维甲酸反应元件相互作用可能是其调控线粒体基因的表达。 维甲酸除调控核基因外, 亦可对线粒体基因进行直接调控。

《中国图书资料分类法》分类号R73-36

The Regulation of Expression of Mitochondrion Gene by All-Trans Retinoic Acid

Zhang Rui, Wang Xuejiao, Wang Xiuqin, Guo Mingzhou, Ding Fang, Liu Zhihua, Wu Min

(National Laboratorty of Molecular Oncology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Beijing 100021)

bstractObjective： To explore the mechanism of prevention and therapy by retinoic acid in cancer and isolate ATRA-target gene and explore the mechanism of expression regulation of mitochondrial gene. Methods： AP-PCR, hybridization, sequencing etc., were used. Results： ATRA up-regulated the expression of mitochondrion gene ATPase subunit 6, the change lasted in whole period of ATRA treatment (from first day to seventh day). The up-regulation was confirmed by Northen blot analysis. Two possible retinoic acid responsive elements (RAREs) were located in the regulation region of mitochondrion genome. Conclusion： The mitochondrion gene expression by ATRA might be regulated through the interaction of retinoic acid receptor (RAR) with RARE in mitochondrion genome

Key wordsretinoic acid； mitochondrion; gene expression regulation

维生素A及其衍生物在脊椎动物的胚胎发育、生长和生殖以及成年动物不同类型细胞的生长、分化中发挥着重要作用^［1～5］。迄今为止，已发现的受维甲酸直接调控的靶基因均由细胞核基因组编码。 我们在分离受维甲酸调控靶基因的过程中发现ATRA可调控线粒体基因组编码基因ATPase第六亚单位的表达。维甲酸受体RAR/RXR和RXR/RXR二聚体可能直接识别线粒体基因组调控区D-loop中维甲酸反应元件并与之相互作用,实现对线粒体基因的调控。

1材料与方法

1.1细胞、菌种及试剂

人食管癌细胞系EC8712，由本室建株并传代培养,建系前组织类型为鳞癌，TNM分期为T₃N₀M；菌株: DH5αF′IQ^TM购自GIBCO/BRL公司；ATRA购自SIGMA公司; (α-³²P)-dCTP (＞3 000 Ci/mmol, 10 μCi/μl), 购自NEN DuPont公司; pGEM-T载体和用于探针标记的Prime-a-Gene^R Labelling System购自Promega公司; 用于总RNA提取的TRIzol^TMReagent购自GIBCO/BRL公司；引物: AP-PCR引物为：5′-GCAATTAACCCTCACTAAAG-3′；tublin 引物：5′-CCCGTCTTCAGGGCTTCTTG-3′，5′-TTAAGGTAAGTGTAGGTTGGG-3′；RARβ引物：5′-TTTCTACACTGCGACGTCCGTCTTCC-3′，5′-CATGCCCACTTCAA AGCACTTCTG-3′。

1.2ATRA诱导人食管癌细胞系EC8712

将人食管癌细胞系EC8712分为3组，ATRA组、DMSO组及对照组。均以80万/瓶接种于50 ml培养瓶中，培养液为含15% 小牛血清的M199培养基。培养24 h后分别向ATRA组、DMSO组及对照组加入溶于DMSO的ATRA(终浓度10^-5 mol/L)，等量的DMSO(终浓度1%)和M199培养基。3组细胞均每天换液, 在处理后1，3，5，7，9 d收获细胞, 提取RNA。

1.3AP-PCR扩增及克隆

按本室改进方法^［6］进行AP-PCR扩增，采用pEGM-T载体克隆差异片段，ABI377 DNA测序^［7］。

1.4探针标记

采用Promega公司随机标记系统标记探针。 采用25 ng双链DNA标记探针。(α-³²P)-dCTP (＞3 000 Ci/mmol, 10 μCi/μl)用量为50 μCi。

1.5Northern杂交

每泳道上样量为30 μg总RNA于含甲醛的凝胶电泳，采用毛细管洗脱法将变性RNA转移至尼龙膜并采用BIO-RAD公司紫外交联仪进行紫外交联。65℃预杂交5 min（预杂交液组成：1 mmol/L EDTA，0.25 mol/L Na₂HPO₄ (pH 7.2)，7%SDS），加入探针，65℃杂交过夜（杂交液组成与预杂交液相同）。65℃洗膜2次，每次15 min，洗膜液组成为：1 mmol/L EDTA，40 mmol/L Na₂HPO₄，5%SDS。再将洗膜液组成更换为1 mmol/L EDTA，40 mmol/L Na₂HPO₄，1%SDS，65℃洗膜2次，每次15 min。用X光片进行放射自显影，-70℃曝光。

2结果

2.1ATRA对食管癌EC8712细胞维甲酸信号传导通路的诱导作用

ATRA处理1，3，5，7，9 d明显上调RARβ的表达，而DMSO处理对该基因表达无影响。表明ATRA处理激活EC8712细胞的维甲酸信号传导通路(图1)。

2.2ATRA诱导差异表达片段的克隆和测序

采用RAP-PCR技术分析ATRA诱导过程中基因表达差异（图2），发现一片段（我们将其命名为AP322）在维甲酸处理EC8712细胞中表达明显增加。将该DNA片段从琼脂糖中回收、纯化, 克隆于pGEM-T easy载体并测序（图3）。同源分析结果显示，AP322与人线粒体ATPase第六亚单位高度一致（同源性99%）。表明该表达升高基因编码ATP酶第六亚单位。

图1全反式维甲酸处理不同时间食管癌EC8712

细胞RARβ表达的RT-PCR结果

Fig.1RT-PCR result of RARβ expression in esophageal cancer

cell line EC8712 by ATRA treatment in different time

M: Molecular weight marker pBR322/Msp Ⅰ; R，D and C indicate the cells treated with ATRA，DMSO and culture medium M199 respectively, the foot number indicate the different treating time. (A)RT-PCR result of RARβ expression; (B) RT-PCR result of tubulin expression as a control. The number on right indicate the length of PCR product

图2全反式维甲酸处理不同时间食管癌

EC8712细胞cDNA AP-PCR结果

Fig.2AP-PCR result of cDNA from esophageal cancer cell line

EC8712 treated with ATRA in different time

R，D and C indicate the cells ureated with ATRA，DMSO and culture medium M199 respectively, the foot number indicate the different treating time, the arrow on the right indicate the fragment with different expression

GCAATTAACCCTCACTAAAGATCCTAGGGCCAGGGCTATTGGTTGAATGAGTAGGCTGATGGTTTCGA

TAATAACTAGTATGGGGATAAGGGGTGTAGGTGTGCCTTGCGGTAAGAAGTGGGCTAGGGCATTTTTA

ATCTTAGAGCGGAAGCCTATAATCACTGCGCCCGCTCATAAGGGGATGGCCATGGCTAGGTTTATAGA

TAGTTGGGTGGTTGGTGTAAATGAGTGAGGCAGGAGTCCGAGGAGGTTAGTTGTGGCAATAAAAATGA

TTAGGGATACTAGTATAAGAGATCAGGTTCGTCCTTTAGTGAGGGTTAATTGC

图3AP322克隆测序结果(全长325 bp)

Fig. 3The nucleotide sequence of AP322 (325 bp)

The fragment was cloned into pGEM-T vector, and sequenced by dideoxy chain termination method using ABI 377 sequencer.

2.3ATRA对线粒体基因组编码基因ATPase第六亚单位转录的影响

Northern杂交结果(图4)显示，该基因表达从ATRA处理1 d开始升高并持续整个诱导过程。 而DMSO处理对该基因表达无影响。Northern杂交信号显示， 该基因mRNA约0.8 kb。