摘要目的： 探讨抗PML-RARα反义核酸对早幼粒白血病细胞生长、细胞周期、细胞凋亡的作用。方法： 以NB4细胞株为研究对象；细胞计数采用台盼兰排除、计数板计数法；白血病细胞集落采用甲基纤维素半固体培养；流式细胞仪(FCM)用于检测细胞凋亡和细胞周期。结果： 以60 μg/ml的终浓度处理细胞，抗PML-RARα融合部位反义核酸（FUAS）能明显抑制NB4细胞增殖及白血病细胞集落(AML-CFU)形成，最大抑制率分别为46.8%，51.6%；GM-CSF能减弱FUAS的作用，FUAS作用时间越短，GM-CSF促AML-CFU增加越明显；FUAS处理第7，9天，出现明显的凋亡细胞群，凋亡细胞百分比分别为41.0%，34.2%；FUAS处理第5天S期下降，G2/M期升高,第7天G0/G1期明显升高，S期回升。结论： 抗PML-RARα反义核酸具有抑制早幼粒白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。

《中国图书资料分类法》分类号R733.7; Q28

Effects of PML-RARα Antisence on the Growth， Cell Cycle and Apoptosis of NB4 Cells

Chen Ye，Miao Jinming，Zhu Xuehong，Shao Nianxian，Fang Zhiwen，Ouyan Rengrong

(Shanghai Institute of Hematology, Renji Hospital. Laboratory of Leukemia Research, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001)

AbstractObjective： To investigate the effects of PML-RARα antisense on the growth，cell cycle and apoptosis of NB4 cells. Methods： Cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry, and leukemic colony forming unit was exammed by methylcellulose assays. Results： PML-RARα antisence （FUAS） could inhibited the growth, and formation of acute myelocytic leukemia colony forming unit （AML-CFU）in NB4 cells； GM-CSF could enhance AML-CFU formation and antagonized the effect of FUAS on AML-CFU formation inhibition. The shorter the time of incubation with FUAS was, the more markedly GM-CSF enhanced the AML-CFU formation. At 7 days, 9 days of treatment with FUAS percentage of apoptotic cells was 41.5%, 34.2% respectively. Reduction of S phase and increase of G2/M phase at 5 days, significant increase of G0/G1 phase with S phase at 7 days. Conclusion: PML-RARα antisence can inhibit the cell growth and induce cell apoptosis of NB4 cells.

Key words acute promyelocytic leukemia； apoptosis； cell cycle; antisence； PML-RARα fusion gene

反义核酸(AS)不仅是一种有价值的体内研究基因功能的工具，而且可作为治疗剂抑制基因表达。AS具有下调癌基因表达的潜能，且毒性低，为某些恶性肿瘤的治疗打开了一条新的治疗途径。NB4细胞株是从复发的早幼粒细胞白血病(APL)病人分离出而建株，具有典型的t(15;17)易位，并表达PML-RARα融合蛋白，在全反式维甲酸（ATRA）诱导下可分化为成熟的粒细胞。本文以NB4细胞株为模型，采用针对PML-RARα融合部位的反义核酸，研究NB4细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期的改变，探讨AS治疗APL的可能性。

1材料与方法

1.1细胞培养及细胞计数

NB4细胞株由上海血液学研究所陈竺所长提供。细胞悬浮生长于RPMI 1640培养液(购自GIBCO公司),内含15％小牛血清(购自上海第二医科大学分部，56℃灭活30 min)、1 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸钠及100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素，于37℃，5%CO₂湿空气中培养。融合部位反义寡核苷酸(FUAS)的序列为：5′CTCAATGGCTGCCTCCCC 3′;正义寡核苷酸(Sen)的序列为：5′GGGGAGGCAGCCATTGAG 3′；随机寡核苷酸(Ran)的序列为：5′GAAGGGCTTTTGAACTCT 3′；后两者作为对照组。所有寡核苷酸的碱基均进行硫化修饰，实验分为FUAS，Sen，Ran，空白对照组共4组。各种寡核苷酸以60 μg/ml的终浓度加入初始浓度为0.5×10⁵个细胞/ml中孵育，18 h后追加寡核苷酸初始剂量的一半剂量，于孵育后不同时间收集细胞，用台盼兰排除、计数板进行计数。

1.2白血病细胞集落(AML-CFU)生长

于寡核苷酸处理后不同时间收集细胞，进行甲基纤维素(FlukaAG,Chemische Fabrik CH-9470 Buchs)半固体培养。各组分别加或不加GM-CSF(每皿250 ng,Schering-Plough Co, Ireland赠送),37℃，5%CO₂恒温湿培养7 d，倒置显微镜下计数集落(判断标准：＞40个细胞的细胞团为集落)。

1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期

收集培养细胞5×10⁵，用冷的PBS洗2次；加入70%冰无水乙醇固定，置-20℃保存至少24 h以上；测试当天，取以上固定细胞，离心2 000 r/min 5 min，用PBS洗2次；细胞悬浮于1 ml PBS缓冲液中，加1％RNA酶100 μl，混匀，加入含Tritonx-100的碘化丙啶(Propidium Iodide,PI, 50 μg/ml)染料，PI的终浓度为25 μg/ml，低温30 min，过滤后上机(FACScan,FCM,Becton Dickinson USA)检测。所有资料经Lysys Ⅱ软件、Celfit软件收集、储存和分析。

2结果

2.1抗PML-RARα反义核酸对NB4细胞生长及白血病细胞集落(AML-CFU)生成的影响

FUAS能抑制NB4细胞株增殖，处理后2，3，4，5，6 d，FUAS的抑制率分别为43.8%(P＜0.01)，42.9%(P＜0.01)，46.8%(P＜0.01)，43.8%(P＜0.01)，15.4%(P＜0.05)，对照组Sen，Ran无抑制作用，细胞计数与空白对照组无明显差异(P＞0.05,见图1)。

3种寡核苷酸处理后,Sen组, Ran组NB4细胞的AML-CFU数与空白对照组无明显差异（P＞0.05),FUAS的AML-CFU形成明显减少(P＜0.01)。处理后24，48，72，96，120 h，AML-CFU分别减少30.8%，39.15%，45.35%，51.6%，45.6%。为了了解GM-CSF对FUAS作用的影响，分别在其作用后24，48，72，96，120 h加GM-CSF，结果见图2。空白对照+GM-CSF组较未用GM-CSF组AML-CFU明显增多，平均增加43.28%（P＜0.01)，Sen+GM-CSF组、Ran+GM-CSF组与空白对照+GM-CSF组无明显差异(P＞0.05)；FUAS+GM-CSF组较未用前有一定的增加，但增加的程度没有空白对照组显著。处理后24，48，72，96，120 h，AML-CFU分别增加33.3%，32.2%，25.1%，21.5%，31.02%（P＜0.05);FUAS作用时间越短，GM-CSF促AML-CFU增加越明显。（见图2）。

图1三种寡核苷酸对NB4细胞增殖的抑制作用(n=3)

Fig.1Effect of oligodeoxynucleotides on the growth

of NB4 cells

图2GM-CSF对FUAS，Sen，Ran作用的影响(n=3)

Fig. 2Effect of GM-CSF on FUAS, Sen, Ran-treated

NB4 cells

2.2抗PML-RAα反义核酸作用后NB4细胞凋亡及细胞周期的动态变化

三种寡核苷酸(60 μg/ml)处理的NB4细胞株，用FCM分析细胞内DNA含量的变化。结果显示，空白对照组为正常的二倍体峰；Sen，Ran组未见峰型的改变；FUAS处理第7，9天，出现明显的凋亡细胞群，即G1峰前出现亚二倍体峰。FUAS处理后3，5，7，9 d的凋亡细胞百分比，分别为9.3%(P=0.05),24.5%(P＜0.01), 41.0%(P＜0.01)，34.2%(P＜0.01)。

寡核苷酸处理后的NB4细胞周期，Sen，Ran组与空白对照组无明显差异。FUAS组第3天无变化;第5天S期明显下降，由对照组的45.63%下降至29.3％，G2/M期则相反，由16.59%升至39.2%;第7天G2/M期下降(5.6%)，G0/G1期明显升高(54.7%)，S期回升(44.75%); 第9天基本正常。

2.3抗PML-RARα反义核酸作用后NB4细胞凋亡与细胞周期改变的关系

从图3可看出，FUAS处理后，G2/M欺逐渐升高，第5天达高峰;第7天见较多的凋亡细胞，伴G2/M期细胞下降，G0/G1期细胞相对增加；G0/G1期细胞在AS处理后3，5 d均无改变，但第7天明显升高伴凋亡细胞增加；细胞凋亡数与S期细胞无明显关系。

图3FUAS处理后NB4细胞凋亡与细胞周期的关系(n=3)

Fig.3The correlation between apoptosis and cell cycle in

FUAS-treated NB4 cells

3讨论

众多的实验研究间接表明，PML-RARα基因以阻断细胞分化和细胞凋亡的双重效应参与APL的发病。针对融合基因的FUAS能明显抑制NB4细胞的增殖和AML-CFU形成，提示PML-RARα基因阻断后，细胞即出现生长阻滞。APL细胞PML-RARα基因的表达大大超过野生型PML和RARα表达。PML-RARα融合蛋白扣押或阻断了残存正常的PML，RARα<