摘要目的： 探讨人膀胱癌多药耐药细胞凋亡诱导途径。方法： 应用免疫细胞化学、原位DNA末端转移酶标记法、相差显微镜及电镜技术，观察BIU-87/ADM细胞表面Fas抗原的表达和抗APO-1单抗对该细胞存活的影响及其特征。结果： Fas抗原在BIU-87/ADM中有高表达，经抗APO-1单抗作用后，BIU-87/ADM细胞存活率明显降低，光镜及电镜下观察到凋亡细胞的形态学改变，原位DNA末端转移酶标记阳性。结论： 抗APO-1单抗能与肿瘤细胞表面的Fas抗原结合，触发人膀胱癌多药耐药细胞凋亡。

《中国图书资料分类法》分类号 R73-361

Apoptosis of Human Bladder Cancer BIU-87/ADM Cells Induced by Anti-APO-1 Antibody

Wang Xiangwei, Yang Tangjun, He Bin, Jin Huansheng, Zeng Yi, Liu Suying

(Department of Urology, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037)

AbstractObjective： To explore the methods of inducing apoptosis in human bladder cancer multidrug resistance cells. Methods： Expression of Fas antigen was detected with immunocytochemistry on BIU-87/ADM cells, and the effect of anti-APO-1 antibody was examined with in situ DNA terminal deoxynucleotydyl transferase assay (TDT)，phase-contrast and electron microscope techniques. Results： We found that Fas antigen was highly expressed on BIU-87/ADM cell surface, and after treatment with anti-APO-1 antibody, survival rate of BIU-87/ADM cells was decreased, apoptotic morphological changes and TDT positive cells were found. Conclusion： These results suggested that anti-APO-1 antibody could induce apoptosis of BIU-87/ADM cells by combining Fas antigen.

Key wordsanti-APO-1 antibody； multidrug resistance; apoptosis

肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance, MDR)是临床肿瘤化疗的严重障碍，深入研究其发生机制及其逆转途径具有重要的意义。我们曾应用阿霉素（adriamycin, ADM）诱导人膀胱癌敏感细胞株BIU-87，成功地建立了耐药细胞株BIU-87/ADM^［1］，并进行了逆转的实验研究^［2］。目前，有关Fas抗原在膀胱癌多药耐药细胞中的表达及抗APO-1对MDR的逆转研究未见报道。本文应用免疫细胞化学技术(immunocytochemistry assay)及原位DNA末端转移酶标记法（in situ DNA terminal deoxynucleotydyl transferase assay），对耐药细胞株BIU-87/ADM中Fas抗原表达及抗APO-1单抗的作用进行研究，结果报告如下：

1材料与方法

1.1细胞株及细胞培养

人膀胱癌BIU-87细胞株引自北京医科大学泌尿外科研究所。耐药细胞株BIU-87/ADM，由我科应用阿霉素大剂量冲击结合低浓度诱导敏感细胞株BIU-87所建立(1994年)。细胞置于含5%CO₂,37℃饱和湿度的孵箱中培养，每3天换培养液1次；细胞融合时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代。

1.2试剂

MTT（噻唑蓝）Sigma出品。鼠源性抗人APO-1单抗(IgG₃)， 由Prof. P.H.Krammer(German Cancer Reserch Center, Germany)惠赠。原位DNA末端转移酶标记试剂盒，购自德国宝灵曼公司。

1.3研究方法

1.3.1细胞生存率测定

采用MTT法。应用DG-3022A酶联仪测定样品吸光度(A)值（570 nm），计算细胞存活率。

1.3.2细胞形态学改变

按1×10⁶/ml 细胞密度接种BIU-87/ADM细胞于玻片上，24 h后按试验分组分别加入不同浓度的抗APO-1单抗（10 ng/ml, 100 ng/ml,1 000 ng/ml）继续培养24 h, 36 h后（对照组加入无药培养液）；于光镜及透射电镜下，观察凋亡细胞的形态学改变。

1.3.3DNA断裂的检测

应用原位DNA末端转移酶标记法^［3］。按1×10⁶/ml 细胞密度接种BIU-87/ADM细胞于玻片上，24 h后按试验分组分别加入不同浓度的抗APO-1单抗（10 ng/ml，100 ng/ml，1 000 ng/ml）继续培养48 h（对照组加入无药培养液）。按文献［3］介绍的方法进行。阳性细胞为胞核呈棕黄色，不着色为阴性。同时应用PBS代替DNA末端转移酶，作为阴性对照。细胞凋亡指数（apoptotic Index , AI）：每张玻片选取5个视野（×400），计数500个细胞，求得阳性百分率。

1.3.4免疫荧光细胞化学染色检测BIU-87/ADM 及BIU-87细胞表面Fas抗原表达

①间接法。②荧光显微镜下观察、摄像。③发黄绿色荧光为阳性。

1.4统计方法

所有数据，以均数±标准差表示；用t检验进行2个样本率的比较。

2结果

2.1细胞存活率

应用MTT法，测定相同时间内（72 h）不同浓度的抗APO-1单抗对BIU-87/ADM细胞存活率的影响。如图1所示，随抗APO-1单抗浓度的增加，BIU-87/ADM细胞存活率明显下降（P＜0.01）。

图1抗APO-1单抗对BIU-87/ADM细胞生存率的影响

Fig.1The effects of anti-APO-1 antibody on the BIU-87/

ADM cell survival rate

2.2凋亡细胞的形态学改变

相差显微镜下观察发现，BIU-87/ADM细胞在100 ng/ml抗APO-1单抗作用24 h后，细胞体积缩小、胞浆固缩、胞核变小，胞膜完整。电镜显示，细胞表面微绒毛消失、细胞核沿核膜内侧边缘固缩，部分细胞核膜消失，核染色质聚集。随作用时间的延长（36 h）及剂量的增加（1 000 ng/ml），上述改变明显加重，并出现核碎裂、胞膜完整性的破坏

2.3细胞凋亡指数（AI）

图2显示不同浓度的抗APO-1单抗作用 BIU-87/ADM细胞48 h后，所诱导的细胞凋亡指数随抗APO-1单抗浓度的增加而增高（各浓度间比较，P＜0.05）。

图2抗APO-1单抗诱导的BIU-87/ADM细胞凋亡指数

Fig.2Apoptotic index of BIU-87/ADM cells induced

by anti-APO-1 antibody

2.4Fas抗原的表达

采用免疫荧光染色法检测Fas抗原在BIU-87/ADM及BIU-87细胞中的表达。荧光显微镜下发现，BIU-87/ADM及BIU-87细胞胞膜发出明亮的黄绿色荧光，呈带状分布（图3，4）。Fas抗原在BIU-87/ADM及BIU-87细胞中的表达无明显差异。

图3Fas抗原在BIU-87/ADM细胞中的表达(×400)

Fig.3 Expression of Fas antigen on human bladder

cancer BIU-87/ADM cell surface (×400)

图4Fas抗原在BIU-87细胞中的表达(×400)

Fig. 4 Expression of Fas antigen on human bladder

cancer BIU-87 cell surface (×400)

3讨论

近年来，有关肿瘤细胞多药耐药发生机制及其逆转研究较多，所采用的逆转途径多依据以下机理：①mdr1基因表达增强；②拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）含量及活性下降；③细胞内谷胱甘肽硫转移酶增多，细胞解毒功能增强等^［4］。鉴于这些机理大多只能解释部分肿瘤细胞多药耐药现象，而且大多数逆转剂毒、副作用大，限制了其临床应用。本文则试图应用抗APO-1单抗诱导膀胱癌多药耐药细胞凋亡。

随着细胞凋亡研究的深入，人们发现许多化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌效应的。细胞凋亡是一种主动的细胞死亡形式，主要表现为形态学变化及DNA的断裂。检测细胞凋亡生化改变所致的DNA断裂方法主要有DNA凝胶电泳、流式细胞仪及原位DNA末端转移酶标记法等^［5］。我们应用光镜、电镜及原位DNA末端转移酶标记法证实, 抗APO-1单抗能诱导人膀胱癌BIU-87/ADM细胞凋亡。我们同时发现Fas抗原在BIU-87/ADM细胞中表达水平较高。BIU-87细胞表面亦有Fas抗原的表达，与BIU-87/ADM细胞相比，无明显差异；而bcl-2及mdr1基因在BIU-87/ADM细胞中有高表达^［6］。