摘要目的： 了解鱼精蛋白应用于血管内皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体的可行性。方法： 利用GV1，GV2靶向性非病毒载体来比较多聚赖氨酸与鱼精蛋白对靶向性基因转移复合体携带DNA的能力及体外基因转移效率的影响。结果： 在A375细胞中，鱼精蛋白与多聚赖氨酸参与形成的复合体基因导入率都为50%左右。在ABAE细胞中，鱼精蛋白参与形成的复合体基因导入率只有20%左右，而多聚赖氨酸可达70%左右。鱼精蛋白参与形成的复合体导入引起的基因表达在转染后第6天达到高峰，传代培养不影响基因的表达水平；多聚赖氨酸在转染后第7天达到高峰，传代培养使基因的导入率明显下降。结论: 鱼精蛋白在血管内皮生长因子受体介导的基因转移系统中的应用具有一定的限制性。

《中国图书资料分类法》分类号R73-36

The Influence of Polycationic Polypetride on the Transfective Efficacy of Non-Viral Vector

Li Junmin, Tian Peikun, Jiang Huiqiu, Gu Jianren

(National Laboratory for Oncogenes and Related Genes, Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032)

AbstractObjective: Purpose to investigate the different in vitro function of targetable non-viral vector containing poly-L-lysine or protamine. Methods： Using GV1 and GV2 targetable non-viral vectors, the influences of the poly-L-lysine and protamine on in vitro gene transfer efficiency and the course of gene expression were observed. Results： β-galactosidase was expressed at intermediate level (50%) in A375 cells using a complex containing either protamine or poly-L-lysine. However, in case of ABAE cells, β-galactosidase expression level was low (20%) transferred with a complex containing protamine. On the contrary, β-galactosidase expression was at high level (70%) provided that protamine was replaced with poly-L-lysine. In addition, β-galactosidase activity reached the peak at the 6th day after transfection with the complex containing protamine. The expression was not altered with subsequent subcultures, at least for 3 passages. Using poly-L-lysine, the expression peak in A375 reached the peak at the 7th day after transfection, but the level declined along with subsequent passages of cells. Conclusion: The apllication of protamine in VEGF receptor mediated gene delivery system was limited.

Key wordsprotamine； poly-L-lysine； VEGF receptor； β-galactosidase gene； gene transfer

DNA-多聚阳离子-配体形成的复合体可以通过受体介导的内吞作用将目的基因靶向性导入含相应配体的细胞中^［1］。目前，大部分受体介导的靶向性非病毒载体都利用多聚赖氨酸作为骨架分子来包裹DNA形成复合体，并在实验室研究中取得了较好结果，但由于多聚赖氨酸的临床安全性未知，难以应用于临床研究。鱼精蛋白是一种富含精氨酸的小分子量的碱性蛋白，在精子形成过程中，取代体细胞核中的组蛋白，参与精子核DNA的凝集^［2］。鱼精蛋白在临床上用于治疗男性不孕症，并可与血液中的肝素拮抗，具有安全性^［3］。在胰岛素样生长因子受体Ⅱ及表皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体系统中鱼精蛋白不仅可以取代多聚赖氨酸并且比它具有更高的基因转移效率。血管内皮生长因子受体介导的GV1，GV2基因转移系统可将目的基因靶向性的转入含血管内皮生长因子受体的细胞^［4］。但是由于鱼精蛋白是一种血管生长抑制剂，对血管内皮生长因子与其受体的结合有抑制作用^［5］，因此，有必要探求鱼精蛋白应用于该基因转移系统的可行性。

1材料与方法

1.1细胞及质粒

A375人恶性黑色素瘤细胞系：由中国科学院上海细胞生物研究所提供。ABAE(bovin aortic arch-derived endothelial cell)牛主动脉弓内皮细胞：由上海医科大学放射医学研究所原代培养。pSV2-β-galactosidase 质粒购自Promega公司。

1.2主要试剂

参照文献［4］。

1.3配体寡肽-多聚阳离子多肽（LOP-PCP）与内吞小体释放寡肽-多聚阳离子多肽(EROP-PCP)的制备

参照文献［4］。

1.4确定共价连接物与DNA的质量数最佳比例

0.2 μg pSV2-β-galactosidase质粒DNA与不同质量比的共价连接物(LOP-PCP, EROP-PCP)混合,室温静置30 min，以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA阻滞情况。

1.5四元复合物(PCP-GV1/HA20/β-gal, PCP-GV2/HA20/β-gal)及五元复合物(PCP-GV1/GV2/HA20/β-gal)的制备与鉴定

参照文献［4］。

1.6复合体介导的β-gal基因体外基因转移

1.6.1传代培养观察复合体对细胞的基因转移

4×10⁵细胞接种于2 ml培养液中，5%CO₂，37℃温育24 h后，待细胞达为60%～70%时，移去培养液，加入含复合体的新鲜培养液，24 h后移去转染培液，用胰酶消化细胞后，按1∶2，1∶4，1∶8，1∶8接种在2 ml培养液中，5%CO₂，37℃继续培养。

1.6.2原代培养观察复合体对细胞的基因转移

2×10⁵细胞接种于1 ml培养液中，5%CO₂，37℃，培养24 h后，待细胞长至满度为40％～50%时，移去培养液，加入含复合体的新鲜培液，继续培养。

1.7细胞染色

参照文献［4］。

1.8基因转移效率的计算

细胞染色后，在倒置显微镜下，计数3个视野中，被染成蓝色的细胞数与未染成蓝色的细胞数，取其平均数，并计算出染成蓝色细胞数占总细胞数的百分比，即为复合体对细胞的基因转移效率。

2结果

2.1PCP-LOP及PCP-EROP共价连接物的构建

DNA与鱼精蛋白参与形成的共价连接物的最佳配比为1∶5（图1A）；而DNA与多聚赖氨酸参与形成的共价连接物的最佳配比为1∶1.5(图1B)。

图1共价连接物的DNA阻滞实验

Fig. 1DNA retardation in 1% agarose gel by conjugates

A: Altered migration of plasmid DNA binded by conjugate GV1/protamine(P-GV1) and GV2/protamine(P-GV2) and HA20/protamine(P-HA20), From 0 to 6, the ratio of DNA to conjugate was 1∶0, 1∶1, 1∶2, 1∶3, 1∶4, 1∶5 and 1∶6. M: λ/Hind Ⅲ markers

B: Altered migration of plasmid DNA binded by conjugate GV1/Poly-L-lysine (P.L-GV1) and GV2/poly-L-lysine (P.L-GV2), From 0 to 5, the ratio of DNA to conjugate was 1∶0, 1∶0.5, 1∶1, 1∶1.5 and 1∶2. M: λ/Hind Ⅲ markers

2.2基因转移复合体的形成

按照共价连接物与DNA的最佳配比包裹好四元复合体与五元复合体，进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察DNA的阻滞，结果如图2所示，具有功能的复合体在凝胶上没有DNA的迁移。

2.3复合物体外对不同细胞进行基因转移的效率及靶向性

2.3.1原代培养观察复合体对受体中度表达的A375细胞的基因转导效率及靶向性

以含0.2 μg DNA复合体每毫升培养液对A375细胞进行转染，于转染后第6天进行细胞染色，结果如图3所示。多聚赖氨酸作为骨架分子的复合体对A375细胞的基因转移效率比鱼精蛋白略高，但是差异并不显著，两者都为50%左右。

图2四元复合体与五元复幌体的DNA阻滞实验

Fig. 2The retardation of DNA in 4-element and 5-element

complexes was examined by 1% agarose gel electrophoresis

A: DNA retardation of different complexes containing protamine, From lane 1 to 3, DNA retardation of complex GV1/protamine/HA20/pSV2-β-gal, GV2/protamine/HA20/pSV2-β-gal, GV1/GV2/protamine/HA20/pSV2-β-gal was examined respectively.

B: DNA retardation of different complexes containing poly-L-lysine, From lane 1 to 3, DNA retardation of complex GV1/poly-L-lysine/HA20/ pSV2-β-gal, GV2/poly-L-lysine/HA20/ pSV2-β-