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《中国图书资料分类法》分类号R730.51； R73-36
Construction of TCR Vβ Nucleic Acid Vaccine and Testing on Its Biological Effects
Zhang Jianzhi,Xu Zuoliang，He Zhongxiao
(The School of Oncologe, Beijing Medical Univercity， Beijing 100036)
AbstractObjective: To construct TCR Vβ nucleic acid vaccine. Methods: A fragment of TCR Vβ gene was amplified by RT-PCR from a human T lymphoma cell line, Jurkat, and cloned into eukaryotic expression plasmid pcDNA3 by gene recombination. After sequencing, the recombinant plasmid was transfected into SP2/0 cells and its expression was detected on mRNA level. BALB/c mice were immunized with pcDNA3 and the recombinant plasmid by intramuscular routes. Antiserum was collected and detected by immunocytochemistry method. Results: A fragment of TCR Vβ gene from Jurkat cells was obtained and proved to be identical to published sequence. A recombinant plasmid pcDNA3-TCR Vβ was constructed. Its expression was detectable on mRNA level after being transfected into SP2/0 cells. Antiserum from mice immunized with pcDNA3-TCR Vβ reacted strongly with Jurkat cells and SP2/0 cells transfected by pcDNA3-TCR Vβ, while shows no reaction on CEM cells expressing TCRγδ and SP2/0 cells. Antisera from normal mice and mice immunized with pcDNA3 were both negative on Jurkat cells. The results of immunocytochemistry indicated that BALB/c mice immunized with pcDNA3-TCR Vβ produced specific antibody to Jurkat TCR Vβ. Conclusion: The TCR Vβ nucleic acid vaccine we constructed can induce humoral immunity.
Key wordsnucleic acid vaccine； human T lymphoma； TCR Vβ
核酸免疫［1］是90年代发展起来的一种全新的免疫技术。它是将编码某一蛋白抗原的基因转移到动物体内，使其在机体内表达形成蛋白抗原，诱导机体产生特异的免疫应答。相应的疫苗称为核酸疫苗。核酸疫苗可在体内表达抗原，能更有效地诱导细胞免疫和体液免疫，尤其是细胞毒T细胞反应。利用核酸免疫在新的环境下表达肿瘤特异性抗原或相关抗原，可能是打破免疫耐受，诱导肿瘤特异性免疫反应的一种有效方法。T淋巴瘤是某种重排的T细胞恶性增殖形成优势克隆的结果［2］，这种恶性增殖T细胞上特异的TCR可以看作肿瘤特异性或相关抗原，进而可通过核酸免疫的方法，诱导机体产生针对恶性增殖的T细胞克隆的免疫反应，从而达到预防和治疗T淋巴瘤的效果。
1材料与方法
1.1主要试剂
各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶，G418购自GIBCO公司；AMV逆转录酶购自Promega公司；DyNAzymeTMⅡ购自Finnzyme OY公司；RNasin,dNTP,Random Primer购自华美公司；PCR引物由赛百盛公司合成；盐酸布比卡因购自上海禾丰制药有限公司；鼠SP 试剂盒购自中山公司。
1.2载体、细胞株和实验动物
人 T淋巴瘤细胞Jurkat 由中国医科院肿瘤所张叔人教授惠赠。人T淋巴瘤细胞CEM由北大医院朱平教授惠赠。小鼠B淋巴瘤细胞SP2/0由本室冻存。真核表达载体pcDNA3购自In Vitrogen公司。BALB/c小鼠购自中国医科院实验动物中心。
1.3人T淋巴瘤细胞Jurkat TCR Vβ基因片段的扩增
1.3.1RNA提取和cDNA合成
用含10%FCS的RPIM 1640培养基培养Jurkat 细胞至足量，用RNAzol提取总RNA。用AMV逆转录酶和随机引物进行cDNA合成。
1.3.2PCR扩增TCR Vβ的基因片段
根据Jurkat 细胞TCR Vβ的基因序列设计引物，上游引物序列为：5′-ACTAGGTACCATGATGATGCGGG GACTGGAGTTG-3′，下游引物序列为： 5′-AGTTGGATCCTTAGGCCTTTTGGGTGTGGGAGAT-3′，含Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点；预期产物长度为330 bp。25 μl体系中，分别含逆转录反应产物2.5 μl，dNTP各0.2 mmol/L,上、下游引物各0.5 mmol/L，10×buffer 2.5 μl, DyNAzymeTMⅡ 1U。PCR扩增程序为：94℃变性2 min，然后，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，循环30次；72℃延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖电泳鉴定。
1.4重组载体的构建
PCR产物和pcDNA3经Kpn Ⅰ和BamHⅠ双酶切后，回收酶切片段。用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化E. coli DH 5α,提取质粒，进行双酶切鉴定。
1.5测序
大量提取双酶切鉴定为正确的重组载体，PEG法纯化后由赛百胜公司测序。
1.6重组载体转染SP2/0细胞及RT-PCR鉴定其表达
用含10%FCS的DMEM培养基培养SP2/0 细胞至足量，用磷酸钙沉淀法将重组载体pcDNA3-TCR Vβ转染SP2/0细胞，24 h后加200 μg/ml G418筛选培养14 d，挑取阳性克隆扩大培养。收集细胞，提取RNA，进行RT-PCR，选取1株RT-PCR鉴定为阳性的细胞SP2/0-2p65进行免疫组化检测。
1.7动物实验
参照文献［3］，选用4～6周龄的BALB/c小鼠，雌性，随机分为3组，每组10只。0.25%盐酸布比卡因注射后肢肌肉，24 h后，相同位点分别注射PBS, pcDNA3，pcDNA3-TCR Vβ，100 μg/只/次，隔3周免疫1次，共免疫3次。末次免疫后3 d取尾血，收集抗血清，用Jurkat,SP2/0-2p65，SP2/0 和CEM细胞涂片进行免疫组化检测。待测血清1∶48稀释。操作程序参照鼠SP 试剂盒使用说明书。
2结果
2.1人T淋巴瘤细胞Jurkat TCR Vβ基因片段的扩增
结果见图1，可看到330 bp目的条带，与预期结果相符合。
图1RT-PCR产物的电泳图谱
Fig.1RT-PCR products of Jurkat cells
1： DNA marker (pBR322/Msp Ⅰ)； 2： Jurkat RT-PCR；
3： Jurkat RT-PCR; 4： Negative control
2.2重组载体的构建
2.2.1pcDNA3- TCR Vβ的构建过程，见图2。
图2pcDNA3-TCR Vβ构建示意图
Fig. 2The construction of pcDNA3-TCR Vβ
2.2.2重组质粒的酶切鉴定。
重组质粒pcDNA3-TCR Vβ用KpnⅠ 和SmaⅠ双酶切割，可得到4.2 kb和1.5 kb两个片段。而同样处理的载体pcDNA3，可得到4.2 kb和1.2 kb两个片段。1.5 kb条带和1.2 kb条带相差0.3 kb,这正是由于所克隆的TCR Vβ用基因片段插入造成的(见图3)。
2.2.3序列分析
经测序证实，pcDNA3-TCR Vβ基因片段的序列与已发表［4］的一致。
2.3重组载体转染SP2/0细胞及RT-PCR鉴定其表达
随机挑选3个克隆扩增培养后提取总RNA，RT-PCR均扩增出330 bp的条带。证明可从RNA水平上检测到TCR Vβ的表达(见图4)。
