摘要目的： 观察用白细胞介素2（interleukin-2,IL-2）基因修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞（dendritic cells, DC）后，DC表达细胞因子和趋化因子的变化及DC体内免疫后，小鼠体内主要脏器中IL-2表达情况。探讨其对抗原提呈微环境的改善及其可能的机制。方法:用ELISA方法检测DC培养上清和小鼠血清及脏器中IL-2的含量，用RT-PCR方法检测DC中IL-2,IFN-γ,IL-12,GM-CSF,IL-4,IL-10,TNF-α,IL-1β,MIP-1β,MCP-1,RANTES和IP10等的表达，用FACS分析DC表面IL-2受体的变化。结果： 经IL-2基因修饰后，DC除了分泌高水平的IL-2外，尚能分泌一定水平的IFN-γ和IL-12，其表面表达的IL-2Rα密度增加。RT-PCR分析表明其表达多种细胞因子和趋化因子，用IL-2基因修饰的DC免疫小鼠后，血清和脏器中能检测到高水平的IL-2。结论： IL-2基因修饰DC，能促进DC表达IL-2受体，并以自分泌形式分泌高水平的IL-2，优化其抗原提呈的微环境，提示可增强DC的抗原提呈功能。

《中国图书资料分类法》分类号R392.1

Effect of IL-2 Gene Modification on the Cytokine Expression in Dendritic Cells

Sun Lifei, Cao Xuetao, Tian Yieping, Zhang Weiping, Zhang Minghui, Huang Xin, Yu Yizhi

(Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433)

AbstractObjective: To investigate the effect of IL-2 gene modification on expression of cytokines and chemokines in dendritic cells (DCs) and IL-2 expression in mouse organs after in vivo DC immunization and to determine the improvement of microenvironment of antigen presentation and its potential mechanism. Methods: The IL-2 levels in DC culture, mouse serum and organs after IL-2 gene-modified DC(DC-IL-2) injection in vivo were examined by ELISA. The mRNA expressions of cytokine and chemokines (IL-2, IFN-γ, IL-12, GM-CSF, IL-4, IL-10, TNF-α, IL-1β, MIP-1β, MCP-1, RANTES and IP10) in DC-IL-2 were analyzed by RT-PCR. The expression of IL-2Rα on surface of DC-IL-2 was analyzed by FACS. Results: After IL-2 gene modification, DCs could secret high level of IL-2, IFN-γ and IL-12. The expression of IL-2Rα on the surface of DC-IL-2 was increased. mRNAs of various cytokines and chemokines were detected. The levels of IL-2 increased immediately in mouse serum, lung, spleen and liver after DC-IL-2 injection in vivo. Conclusion: The IL-2 gene modification could enhance the biologic activity of the DCs and the microenvironment of antigen presentation was optimized.

Key wordsinterleukin 2; dendritic cells; gene modification; cytokine; chemokines

树突状细胞（dendritic cells, DC）是抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞，其在肿瘤治疗中的应用是近年来的热点课题。利用细胞因子基因修饰DC，通过选择性增强DC与T细胞体内的相互作用，优化体内抗原提呈的微环境，是目前肿瘤免疫治疗研究的重要方法之一。本文研究了白细胞素2(inderleukin-2),IL-2基因修饰DC后，DC分泌有关细胞因子的含量和DC表达IL-2受体的变化，探讨IL-2基因修饰对DC生物活性的影响。并用IL-2基因修饰的DC（DC-IL-2）体内免疫小鼠后，观察了IL-2在体内某些脏器中的表达情况，以期了解DC-IL-2在体内这些脏器中的分布情况，以及对这些脏器中免疫细胞能否起到有效激活作用，对其抗原提呈微环境是否有利等提供实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂

小鼠IL-2重组腺病毒Ad-IL-2,LacZ重组腺病毒Ad-LacZ由日本癌症研究会Hamada博士惠赠,病毒滴度分别为3×10⁹,1.9×10⁹ pfu/ml。重组小鼠GM-CSF,IL-4,重组人IL-2购自Sigma公司。小鼠IL-2和IL-12p70 ELISA检测试剂盒购自Endogen公司。Taq 酶为TAKARA公司产品。PCR引物由中科院上海细胞所合成。琼脂糖购自Amecesoc公司。PCR Marker购自华美公司。荧光标记的大鼠抗小鼠Ia和IL-2Rα抗体购自PharMingen公司。

1.2动物

C57BL/6小鼠（H-2K^b）雌性，6～8周龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。

1.3IL-2基因修饰的DC 培养上清中细胞因子含量的测定

用补体介溶法以大鼠抗小鼠CD4，CD8，B220/CD45R，Ia和FcR单抗加低毒性兔补体溶解阴性选择的骨髓细胞（1×10⁶/ml），用含10％FCS和重组小鼠GM-CSF（5 ng/ml）加重组小鼠IL-4（1 ng/ml）的RPMI 1640培养基在24孔板中常规制备正常小鼠骨髓来源的DC细胞。培养至第7天，收集悬浮细胞及疏松贴附于巨噬细胞的DC，置于另一培养板中（1×10⁶/ml），将Ad-mIL-2，Ad-LacZ腺病毒，分别对1×10⁶/ml DC转染4 h，（MOI值＝100），用Hank's洗涤2次，去除病毒后重悬基因转染过的DC以1×10⁶/ml浓度在DC条件培养液中继续培养48 h，于转染后24,48 h分别收集培养上清，-20℃保存，以ELISA 法检测上清中IL-2,IL-12和IFN-γ的分泌水平。

1.4相当剂量重组IL-2培养的DC制备

我们以往的研究中已证实IL-2基因修饰DC 24 h和48 h，DC的培养上清中IL-2的分泌量分别为3.25 ng/ml和5.0 ng/ml。故将正常培养至第7天的DC，以同等条件在其培养基中加入人重组白细胞介素2(rhIL-2) 5 ng /ml，继续培养24 h后，用Hank's液洗涤2次，按上述方法处理备用。无菌收取rhIL-2培养DC 24 h的上清，-20℃保存备用。

1.5IL-2基因修饰的DC细胞因子m RNA的表达

1.5.1实验分组，取上述处理的DC共分5组：(1)培养至第7天的正常DC（N7-DC）；(2)培养至第8天的正常DC（N8-DC）；(3) IL-2基因修饰的DC（DC-IL-2）；(4)LacZ 基因修饰的DC（DC-LacZ）；(5)相当剂量（5 ng/ml）rhIL-2培养的DC（rhIL-2-DC）。

1.5.2RT-PCR操作步骤，取5组细胞各2×10⁶，以PolyATtrct System 1000(Promega)提得mRNA，OligodT_12～18引导下AMV(promega)将其反转录成cDNA后，PCR检测IL-2，IFN-γ，GM-CSF，IL-4，IL-10，TNF-α，IL-12p40，IL-11β，MCP-1，RANTES，MIP-1β和IP10的表达。检测对照基因为β-actin。PCR反应在PE公司9600型DNA扩增仪上完成。反应参数为95℃ 10 s；55℃ 30 s；72℃ 20 s；30个循环，以2%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。所用的PCR引物序列分别为：

小鼠β-actin: 上游：5'GCT GAG AGG GAA ATC GTG

下游：5'GGG TGT AAA ACG CAG CTC

小鼠IL-2： 上游：5'TCC ACT TCA AGC TCT ACA G

下游：5'GAG TCA AAT CCA GAA CAT GCC

小鼠IFN-γ： 上游：5'CAT GAA AAT CCT GCA GAG CC

下游：5'GGA CAA TCT CTT CCC CAC CC

小鼠IL-10： 上游：5'ACA ACA TAC TGC TAA CCG AC

下游：5'CAC CTT GGT CTT GGA GCT TA

小鼠TNF-α： 上游：5'GCA GGT CTA CTT TGG AGT CA

下游：5'ACA TTC GAG GCT CCA GTG AA

小鼠IL-12p40： 上游：5'TCA CAG GTG GAG GTC AGC

下游：5'GGC CAA GTG GAA TGC TAG

小鼠IL-1β： 上游：5'TGG ACC TTC CAG GAT GAG

下游：5'TGG GTA TTG CTT GGG ATC

小鼠MCP-1： 上游：5'CAG TAC GAT CCT CAC GAA TG

下游：5'TGT CCA ATT TCT CAA ACC TG

小鼠RANTES： 上游：5'ATG AAG ATC TCT GCA GCT GC

下游：5'TGA ACC CAC TTC TTC TCT GG

小鼠MIP-1β： 上游：5'CTC TCT CTC CTC TTG CTC GT

下游：5'CAT GTA CTC AGT GAC CCA GG

小鼠IP10： 上游：5'GTC ATT TTC TGC CTC ATC CT

下游：5'GAC CTT TTT TGG CTA AAC G

小鼠GM-CSF： 上游：5'TAA ATG ATA ATT GTT ACC CGG CCT TGG

下游：5'AAG GAT CCT CAT TTT TGG CTT GGT TTT TTG

小鼠IL-4： 上游：5'ATT ATG CAT ATC CAC GGA TGC GAC AA

下游：5'AAG GAT CCT TAC GAG TAA TCC ATT TGC ATG A

1.6IL-2基因修饰的DC表面IL-2受体的表达

采用荧光抗体直接标记法，分别对上述正常培养第8天的DC，及经基因修饰的DC和rhIL-2培养的DC，用PE标记的小鼠IL-2Rα和FITC 标记的小鼠Ia单克隆荧光抗体4℃标记1 h，以小鼠血清封闭非特异性荧光染色，无关抗体作阴性对照。流式细胞仪（FACS）进行IL-2Rα和Ia双标记检<