摘要目的： 我们应用逆转录病毒构建了IL-12，B7-1和GM-CSF表达载体，以研究基因修饰的肿瘤细胞的癌疫苗作用。方法： 将3种表达载体分别转染EL-4胸腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。结果： 当接种了EL-4/IL-12细胞后，在C57BL/6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL-4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P＜0.01)。在EL-4/IL-12被排斥后，体内试验中诱发了实验动物抗EL-4/Wt的系统性、保护性免疫，⁵¹Cr释放测定中，获得一个较强的抗EL-4/Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性，体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的肿瘤原性主要依赖于CD4⁺，CD8⁺和NK细胞。用EL-4/IL-12细胞进行疫苗治疗比较用EL-4/Neo细胞能有效地延缓已建立的EL-4/Wt肿瘤的生长(P＜0.005)，EL-4/IL-12和EL-4/B7-1联合比用单一的转基因细胞增强了治疗效果(P＜0.005)。结论： 提示应用IL-12进行血液肿瘤的治疗是有效的，IL-12和B7-1联合使用在未来人类癌症的治疗中亦可有一定的应用前景。

《中图图书资料分类法》分类号R730.3； R730.51

IL-12 Synergizes B7-1 Enhance the Antitumor Immunity in Experimental Mice

Wang Zhihua， Kang Xixiong， Kenzaburo Tani， Hidetoshi Sumimoto, Yakon Nakazaki, Shigetaka Asano

(Institute of Oncology,Harbin Medical University,Harbin 150040)

AbstractObjective: To study the vaccine potency of gene-modified tumor cells, we have constructed IL-12,B7-1 and GM-CSF express vector using retrovirus. Methods: It was transfected into EL-4 thymic lymphoma cells respectively and the effect of gene transduction on anti-tumor immunity were investigated. Results: The tumorigenicity of EL-4/IL-12 transfectant in C57BL/6 synergistical mice was decreased significantly after implanted with EL-4/IL-12 transfectant compaired with EL-4/Wt or EL-4/Neo groups (P＜0.01).The systemic protective immunity was induced against the challenge with EL-4/Wt (in 10/15 mice) after the rejection of EL-4/IL-12 in vivo experiment,a stronger CTL activity against EL-4/Wt cells and a weak killer activity against syngeneic Lewis Lung Carcinoma cells were obtained in ⁵¹Cr release assay. In vivo depletion analysis suggested that the decrcased tumorigenicity mainly depended on CD4^＋,CD8^＋ and NK cells. Therapeutic vaccines with EL-4/IL-12 cells could retard the growth to estabished EL-4/Wt tumors significantly compared with those of EL-4/Neo (P＜0.005)， combination of therapeutic vaccines of EL-4/IL-12 and EL-4/B7-1 result in the enhanced the therapeutic effect of each single transficants (P＜0.005) in this experimental model. Conclution: These studies suggested that immunogene treatment using IL-12 is effective in hematopoietic malignancy,and combination of IL-12 with B7-1 have a aplication value in human cancer treatment in the near future.

Key words IL-12; B7-1; GM-CSF; cancer vaccine; gene therapy

近年，很多研究显示在动物和人类抗肿瘤免疫中T淋巴细胞扮演一个重要的角色^［1］。T淋巴细胞活化需要二个信号，一个是由T细胞受体传递的抗原特异性信号，第二个是抗原非特异性的或称共刺激信号由辅助受体和抗原提呈细胞(APCs)上表达的配体结合后进行传递^［2］。B7-1的表达只限于APCs，如树突状细胞，活化的B细胞和单核/巨噬细胞^［3］。APCs表面的B7分子和他们的对应受体、T细胞表面的CD28相互反应启动了一个共刺激信号，它补充了抗原-MHC复合物对T细胞受体的刺激，导致T细胞表达IL-2及IL-2受体，诱发克隆增生和免疫反应的启动^［4，5］。另一方面，几种肿瘤细胞也被用来表达特定的细胞因子以诱发保护性免疫。在这些细胞因子中，白细胞介素12(IL-12)在Th1细胞产生与活化及细胞毒性CD8⁺细胞的产生被认为是一个主要的因子。IL-12的抗肿瘤效果首先是由CD8⁺T细胞介导的，在很多实验体系中需要IFN-γ的参与，IFN-γ的重要性源于它作为IL-12的介导者可诱发CD4⁺Th1细胞发生。另有报告提示IL-12对T细胞的刺激作用可由B7-1共刺激而协同增强，二者的结合能使T细胞更好的增生及产生更多的细胞因子^［6］。

在以往的研究中，我们调查了经照射的GM-CSF和B7-1转基因WEH-1慢性单核性白血病细胞、EL-4胸腺瘤和Lewis肺癌细胞的抗肿瘤免疫效果，指出经照射的转基因肿瘤细胞显示较强的疫苗作用^［7］。

本研究中，我们估价了IL-12对EL-4胸腺瘤细胞的肿瘤原性的影响，并进一步研究了IL-12，GM-CSF和B7-1分子在癌疫苗治疗中协同作用的可能性。

1材料和方法

1.1实验动物

雌性C57BL/6小鼠，6～8周龄，购于日本CLEA公司，所有实验均于8～12周龄进行。

1.2细胞株

EL-4胸腺瘤细胞由美国ATCC获得、常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液。GK1.5和53.6-72杂交瘤细胞(均源于ATCC)维持在RPMI 1640培液中(含10%胎牛血清)。通过逆转录PCR进行小鼠IL-12的cDNA克隆，该cDNA插入TFG载体以产生TFG-mIL-12-Neo^［8］(见图1)。用磷酸钙沉淀法将载体转染Ψcre包装细胞，然后用G418选择法挑选具有抵抗性的克隆细胞，含重组TFG-mIL-12-Neo的逆转录病毒产生细胞维持在含有10%胎牛血清的DMEM培液中，37℃，5%CO₂孵箱中培养。

1.3基因转导

将转染了TFG-mIL-12-Neo包装细胞培养上清转染EL-4细胞，然后将此细胞应用有限稀释和G418(800 μg/ml)筛选法进一步克隆化^［8］。由此获得转IL-12基因的IL-4细胞，即EL-4/IL-12细胞株。转染小鼠GM-CSF cDNA或B7-1 cDNA的EL-4细胞株也通过类似的方法获得^［7］。

1.4单克隆抗体与FACS分析

FITC标记的抗CD80(IG10)、抗CD86(GL1)、抗H-2K^b(SF1-1.1)、抗I-A^b(Ams-32.1)、PE标记的抗H-2D^b(34-2-12)、生物素标记的抗H-2K^b/H-2D^b(28-8-6)单克隆抗体从Pharmnigen公司购买。cDNA转基因肿瘤细胞CD80，MHC class Ⅰ(H-2K^b和H-2D^b)和classⅡ(I-A^b)抗原的表达用流式细胞仪(Becton-Dickinson, San Jose. CA. USA)加以检测及分析。

1.5肿瘤原性测定

1×10⁵ EL-4/IL-12(32)或EL-4/Wt或EL-4/Neo细胞混悬在大约0.1 ml HBSS当中，然后将其注射于同系C57BL/6小鼠右侧背部皮内，当可以检测到的肿瘤出现时(直径约大于2 mm)，每2天或4天用游标卡尺进行测量。28 d后，再将1×10⁵ EL-3/Wt细胞经皮内注射已经排斥了EL-4/IL-12(32)细胞的实验小鼠的左侧背部，以研究是否发生了系统的抗肿瘤免疫。

图1TGF-mIL-12-Neo载体的构建略图

Fig. 1Constructron of TFG-mIL-12-Neo vector

1.6转基因细胞的肿瘤治疗

将1×10⁵EL-4 ／Wt肿瘤细胞皮内接种于实验小鼠的右侧背部(第0天)，其后，5×10⁴EL-4 ／Wt细胞分别和5×10⁴各种转基因细胞混合(1∶1)分3次，(第3,6,9天)注射左侧背部皮内，肿瘤的生长情况每2天或4 天观察1次。

1.7CTL活性测定

在转基因细胞接种后56天时将排斥IL-12转基因的和其后用EL-4/Wt激发的实验鼠的脾脏取出，按照制造商家说明书经-尼龙纤维柱获得去除红细胞的富含T细胞的组分，这些效应细胞通过在体外和EL-4/Wt进行5 d培养再行刺激。靶细胞EL-4/Wt或野生型Lewis肺癌细胞(LLC/Wt)通过在100 μCi ⁵¹Cr铬酸钠存在下37℃,5%CO₂，2 h培养而获得，标记的靶细胞依不同的效/靶比例和效应细胞进行共孵育，4 h后，用自动γ-记数仪测定培养上清的放射活性， 并计算特异溶解的百分比。

1.8体内去除实验

基本参照以前的测定方法。简言之，抗小鼠CD4和CD8抗体分别通过CK1.5和53.6-72细胞获得，过Hitrap柱(pharmacia biotech)后，再用EZEP纯化。在连续3 d腹腔给0.5 mg抗CD4或抗CD8或用作对照的HBSS(总容积每只1～2 ml，每组4只C57BL/6小鼠)后，将5×10⁵ EL-4／IL-12细胞接种于右侧背部。此后第3天和第6天经腹腔再注射抗体或HBSS，并每隔2～3天进行瘤块测量。抗asialo GM1单克隆抗体用于NK细胞的去除。简言之，5只C57BL/6小鼠给予200 ng抗asialo GM1单克隆抗体(前1天和前5天)，其后接种EL-4/IL-12细胞5×10⁵，后3天和后7天再行抗asialo GM1单