【摘要】目的改善肿瘤细胞共刺激分子B₇的表达。方法将ALA₉₇₀₂肺癌细胞与活化的B淋巴细胞用聚乙二醇进行细胞融合，经ELISA及免疫细胞化学筛选后，用S-P免疫细胞化学染色观察融合细胞的肺癌抗原及B₇分子的表达，并观察融合细胞的体内外生长情况。结果经筛选获得一株融合细胞FLB_2C。融合细胞既表达肺癌抗原，又表达B₇分子。体外培养显示其贴壁性较ALA₉₇₀₂肺癌细胞减弱，生长明显变缓，细胞倍增时间延长，不能在软琼脂中形成集落。接种融合细胞亦不能在小鼠体内成瘤，而接种ALA₉₇₀₂细胞的10只小鼠中6例腋下出现肿瘤生长，3例还发生肺转移。结论通过细胞融合方法可以有效改善肿瘤细胞的B₇分子表达，从而提高肿瘤细胞的抗原性。融合细胞FLB_2C的致瘤性明显减弱，为制备更有效的肺癌疫苗奠定了基础。

【中图分类号】Q813

Establishment and growth characteristics of mouse lung cancer B₇ fusion cells

LIN Ping,LU Yanrong,ZHANG Jie,HUANG Xiaozhong,JIANG Yinghong

(Cancer Institute and Cancer Center,The First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu,Sichuan 610041,P.R.China)

【Abstract】ObjectiveTo ameliorate expression B₇ molecule of tumor cell.MethodsMouse lung cancer cell line ALA₉₇₀₂ and active B lymphocytes were fused by polyethylene glycol.After screening with ELISA and immunocytochemistry,the expression of lung cancer antigen and B₇ molecule in the fusion cells were monitored by S-P immunocytochemistry staining.Proliferation of the fusion cells was observed in vitro and in vivo.ResultsA fusion cell line,FLB_2C,was obtained through screening.FLB_2C could express the lung cancer antigen and B₇ molecule.The results of in vitro culture showed that the wall adherence characteristic of FLB_2C was abated and the growth of FLB_2C was slower than that of ALA₉₇₀₂.The cell multiplication time of FLB_2C prolonged and no colony was formed in soft agar.No tumor mass was observed in vivo after inoculation of FLB_2C into mice.ConclusionExpression of B₇ molecule in tumor cell can be ameliorated through cell fusion,thereby antigenicity of tumor cell will be raised.The oncogenicity of FLB_2C is obviously weakened through fusion with normal cells.This provides the basis for preparation of better lung cancer vaccines.

【Key words】Lung cancer fusion cellExpression of B₇ moleculeEstablishmentBiological feature

近年来，对肿瘤疫苗的研究成为了肿瘤免疫治疗的一个热点，其中最关键的是改善肿瘤细胞的共刺激分子表达以提高肿瘤免疫源性。以往的疫苗细胞不能十分有效地刺激机体产生保护性免疫反应的重要原因之一是肿瘤细胞多数低表达或不表达 B₇分子^［1］，即缺乏 T细胞免疫应答所需的共刺激信号。我们将小鼠肺癌细胞与活化的B淋巴细胞融合，观察到融合细胞既能表达肺癌抗原又能表达B₇分子，且其生物学性质有所改变。现将该实验报告如下。

1材料与方法

1.1试剂和材料HAT培养液为Sigma产品，用含15％小牛血清的1640培养液制成终浓度为次黄嘌呤（H）1×10^－4?mol／L、氨基喋呤（A）4×10^－7?mol／L、胸腺嘧啶（T）1.6×10^－5?mol／L。RPMI1640培养液为Gibco BRL产品，含15％小牛血清、100?μg／ml青霉素和100?μg／ml链霉素。聚乙二醇（PEG）为Merck产品，分子质量为4?000?u，使用浓度为50％。MAb B₇购自Parmagen公司。LPS购自Difco公司。ALA₉₇₀₂细胞为我所建立的HGPRT缺陷的小鼠Lewis肺癌细胞株^［2］，常规培养于1640培养液中。兔抗ALA₉₇₀₂抗体（RαA）和兔抗小鼠活化B淋巴细胞抗体（RαB）由本所接常规方法制备。昆明小鼠由华西医科大学动物实验中心提供。

1.2细胞融合制备疫苗自昆明小鼠脾细胞中分离B淋巴细胞，用LPS（17?μg／ml）刺激培养3天，收集其细胞制成细胞悬液作融合用。将ALA₉₇₀₂细胞与小鼠活化的B淋巴细胞以1∶10比例混合，经50％PEG融合后，用HAT培养液在37℃、5％ CO₂下培养于96孔板中。10天时，对照ALA₉₇₀₂细胞死亡，换用HT培养液培养一周，再用1640培养液常规培养，用RαA和RαB抗体通过ELISA法测定上清液中相应的反应值进行初筛，选择二者反应均高（即光密度OD值高）且生长良好的细胞进行扩增，作有限稀释克隆，进一步用MAb B₇ S-P免疫细胞化学染色筛选法选择强阳性细胞扩增，将其作为疫苗细胞。

1.3S-P免疫细胞化学染色将细胞悬液制成细胞涂片，用4℃丙酮固定10分钟，1％ BSA封闭后，滴加MAb B₇ 5?μg／ml，4℃过夜，按常规进行S-P免疫化学染色，在光镜下观察，以棕黄色为阳性反应。

1.4疫苗细胞肺癌抗原及B₇分子的表达疫苗细胞增殖传代后，制成涂片，分别用RαA、MAb B₇进行S-P免疫细胞化学染色。

1.5疫苗细胞的生长曲线及倍增时间在光镜下观察细胞形态，常规台盼兰排染法测定活细胞数，绘制生长曲线。细胞倍增时间以下列公式计算：

Td＝T lg2

lgN

N₀

其中Td为倍增时间（小时），N₀为起始细胞数，N为终止细胞数，T为从N₀到N的时间。

1.6软琼脂培养实验将疫苗细胞和ALA₉₇₀₂细胞分别以每平皿500个细胞接种于含0.24％琼脂糖的培养皿中，每株细胞重复3个培养皿，在37℃、5％ CO₂中培养15天，以大于20个细胞数的集落记录，镜下计数每平皿各细胞株的集落数。

1.7体内成瘤实验疫苗细胞和ALA₉₇₀₂细胞分别按每只3×10⁶细胞皮下接种于20?g左右的昆明小鼠右前腋下，以生理盐水为空白对照，每组各10只，观察成瘤率及肺转移情况。

2结果

2.1疫苗细胞的建立当ALA₉₇₀₂和活化的小鼠B淋巴细胞融合后，由RαA和RαB筛选出15孔反应强、生长良好的细胞，进一步克隆后用MAb B₇选择一株反应最强的细胞，将其作为疫苗细胞，命名为FLB_2C。

2.2细胞体外生长情况FLB_2C疫苗细胞呈圆形，为半贴壁生长，而且贴壁的细胞经轻微摇动即可掉下；ALA₉₇₀₂细胞亦为贴壁生长，但在传代后期多呈短梭形状且贴壁紧密。FLB_2C和ALA₉₇₀₂细胞倍增时间分别为46.82和28.41小时。两株细胞的生长曲线见图1，图中显示FLB_2C细胞生长明显变缓。

图 1FLB_2C和ALA₉₇₀₂细胞株的生长曲线

Fig 1Growth curves of FLB_2C and ALA₉₇₀₂ cell lines

2.3融合细胞肺癌抗原及B₇分子的表达S-P免疫细胞化学染色显示ALA₉₇₀₂细胞仅表达肺癌抗原，不表达B₇分子，而FLB_2C细胞则既表达肺癌抗原，又表达B₇分子，B₇分子主要分布在细胞膜及细胞浆(图2)。

图 2FLB_2C细胞株表达B₇分子的S-P免疫细胞化学染色

Fig 2MAb B₇ S-P immunocytochemistry staining of FLB_2C cell line

2.4软琼脂集落形成情况FLB_2C、ALA₉₇₀₂细胞株在软琼脂平皿中每皿集落数分别为0和169，有显著性差异（P＜0.01)。

2.5体内成瘤情况ALA₉₇₀₂组中有6只小鼠腋下出现肿瘤生长，3只还发生肺转移，病理切片显示生长的肿瘤呈腺癌；而FLB_2C组和生理盐水组小鼠仅在接种部位有轻度炎症反应，未见肿瘤细胞。

3讨论

T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要机制。随着对抗原的识别和提呈，以及T细胞激活等免疫应答机理认识的不断深入，人们已经认识到有效的抗肿瘤免疫反应必需有共刺激信号的参与，将肿瘤抗原多肽提呈给T细胞而激发 T细胞的免疫应答