【摘要】目的探讨低能超声对人肺癌细胞的影响。方法用低能量连续波超声处理小细胞肺癌细胞系SM、腺癌细胞系A₂及人肺纤维母细胞FB，用胎盘蓝染料排斥试验及克隆存活试验判定效果。结果低能量（0.8W／cm²）超声3分钟对各种人肺癌细胞及人肺纤维母细胞有杀伤作用(P＜0.05 )，10分钟可杀死全部细胞(P＜0.001 )。细胞浓度越高，杀伤作用越低。超声10分钟后含细胞悬液的试管内温度未见显著上升。声强0.8W／cm²的超声使阿霉素对肺癌细胞SM的杀伤作用增加100倍(P＜0.001)。结论低能连续波超声可杀伤肺癌细胞，并能显著增加阿霉素对肺癌细胞的细胞毒性。

【中图分类号】R73-36

Killing effect of low intensity ultrasound on human lung cancer cells in vitro

ZHAN Xiuping,WANG Yue,LAI Baitang

(Cellular and Molecular Biology Lab,Beijing Thoracic Tumor Research Institute,Beijing 101149,P.R.China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of low intensity ultrasound on human lung cancer cells.MethodsThe human small cell lung cancer cells line SM,adenocarcinoma cell line A₂ and human lung fibroblast cells FB were treated with low intensity ultrasound,and the killing effects of ultrasound on the cells were detected by the trypan blue exclusion and clonogenic survival assay.ResultsThe killing effects of low intensity ultrasound (0.8W／cm²) on various type of human lung cancer and human pulmonary fibroblast were observed after 3-minute treatment.All of the cells were killed by sonicate for 10-minute treatment.The higher the cell concentration,the lower the killing efficiency.The temperature in the tube containing cell suspension did not obviously increase after 10-minute sonicate.Compared with the application of doxorubicin alone,the doxorubicin cytoxicity was increased by 100-fold in SM cell cologenic survival assay when doxorubicin was combined with an intensity of ultrasound at 0.8W／cm².ConclusionThe low intensity continuous wave ultrasound can obviously kill lung cancer cells and dramatically increase the cytotoxicity of doxorubicin for lung cancer cells.

【Key words】Lung neoplasmsUltrasoundIn vitroDoxorubicin

近年应用超声波治疗肿瘤的研究日益受到人们关注，对于应用高能聚焦超声产生局部高温来治疗肿瘤的新技术更寄予厚望。超声波是一种高频率的机械波，在组织中传播时，除产生明显的热效应外，还产生机械作用和空化作用。高温聚焦超声治癌的主要原理是升温作用，但它所产生的局部高温不易控制，而且对肿瘤深部的温度不易测量。本研究主要探讨低能超声波对癌细胞的影响，以及低能超声波对阿霉素细胞毒的增强作用，探索超声用于肿瘤治疗的可行性。

1材料与方法

1．1肺癌细胞人肺小细胞癌细胞系SM^［1］及人肺腺癌细胞系A₂^［2］由我所建立。人肺纤维母细胞FB为自人肺切除标本培养的纤维母细胞，人肺大细胞癌细胞系801-D来自301医院。各细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养。用0.25％胰蛋白酶及0.02％EDTA常规消化后传代，取对数生长期细胞用于试验。

1.2超声波仪采用鞍山市无线电一厂制造的JWC-2A型晶体管超声波雾化器改装而成，频率1.7 MHz，声强为0.8 W／cm²。

1．3超声波对癌细胞的杀伤实验将上述生长良好之细胞常规消化后，重新悬浮于培养基中，使终浓度为10⁷／L、10⁸／L及10⁹／L，分装于直径1.2 cm、高10 cm之玻璃小试管中，每管1 ml，分别置于0℃、25℃、37℃水浴中保温备用，超声波治疗机之水槽分别充满0℃、25℃、37℃水保温。实验时将小试管底部中心对准超声换能片中心，并使试管插入水面深度保持在管内外水面持平，超声过程中每10秒晃动试管1次，超声处理时间为10秒、30秒、3分钟及10分钟，然后以等量0.04％胎盘蓝染色计活细胞数。每组试验均为双管，取平均数计算超声波的杀伤作用。

1．4超声波对阿霉素细胞毒性的增强作用将人肺癌细胞SM常规消化后，悬浮于新鲜培养基中使终浓度为10⁷／L，分装于小试管中，每管1 ml，分为4组。对照组、超声组：超声处理3分钟；阿霉素组：用0.5 μg／ml阿霉素在37℃处理细胞3小时；阿霉素＋超声组：用0.5 μg／ml阿霉素在37℃处理3小时后再超声处理3分钟。细胞处理后经Hanks液洗3次，以培养基悬浮后接种于24孔塑料培养板之第1行，后以10倍稀释法稀释至第6行，置于5％CO₂暖箱中培养10天后计数细胞集落。每组实验均为双管，取平均数计算超声波对阿霉素细胞毒作用的影响。

1．5超声波的升温作用按第3步方法在0℃、25℃及37℃下超声10分钟，在含细胞悬液之试管内插入温度传感器，用天津立文电子有限公司之JW222数字温度计，在超声同时，每10秒钟记录一次试管内温度。该温度计分辨率为0.1℃，准确度为±0.2％，每0.4秒可报告温度1次。

1．6统计学处理采用χ²检验，以P＜0.05为差异显著。

2结果

2．1细胞浓度对超声杀伤癌细胞的影响0℃下超声10分钟，SM细胞在浓度为10⁷／L及10⁸／L细胞时，可杀死全部细胞(P＜0.001)，甚至仅处理3分钟亦可杀死98％及80％细胞(P＜0.05 )；而在10⁹／L浓度时，超声10分钟仅杀死近30％细胞(P＞0.05 )，仍有72％～75％细胞存活，可见，0℃下随着细胞浓度的增加，超声对癌细胞的杀伤作用明显减弱（图1）。

2．2温度对超声杀伤癌细胞的影响SM细胞浓度为10⁹／L，在0℃下处理10分钟仅杀死约30％SM细胞，并且与对照的未进行超声处理组无显著性差异(P＞0.05)，但增加温度至25℃及37℃，处理3分钟可杀死全部SM癌细胞(P＜0.001)。

2．3超声对不同类型细胞的杀伤作用取浓度为10⁸／L的SM、A₂ 、801-D及FB细胞，作超声杀伤细胞实验，以胎盘蓝染色判断杀伤效果，结果如图2：在0℃下超声30秒对各细胞系显示出显著的杀伤作用(P＜0.05)，超声10分钟可杀死各系的全部细胞(P＜0.001)，在不同的细胞系之间及癌细胞与纤维母细胞之间，超声杀伤的效果相近。

2.4超声对试管内细胞悬液温度的影响在0℃、25℃及37℃，细胞浓度为10⁸／L时，低能超声10分钟后，温度仅上升1℃，随着每10秒晃动试管，使用低能超声10分钟并未引起试管内温度显著上升。

图 1细胞浓度对超声杀伤SM癌细胞的影响(0℃)

Fig 1Influence of cell concertration of SM cancer cells on killing effect by ultrasound (0℃)

图 2超声时间对不同类型细胞的杀伤作用

(细胞悬液浓度为10⁸／L、0℃)

Fig 2Influence of ultrasound time on killing effects to different histological cells

(cell concentration 10⁸／L，0℃)

图 3超声对阿霉素对人肺细胞癌系SM的细胞毒的影响

Fig 3Effect of ultrasound on cytotoxicity of doxorubicin for SCLC cell line SM

2.5超声对阿霉素细胞毒性的影响经0.5 μg／ml阿霉素处理后，用声强为0.8 W／cm²的连续波超声3分钟，人肺小细胞癌SM比单用阿霉素处理组的SM细胞存活降低100倍(P＜0.001)（图3）。

3讨论

低能超声对细胞的杀伤作用已有一些报告^［3］，用0.33 W／cm²处理细胞4分钟，有75％以上黑色素瘤细胞及乳癌细胞死亡，但仍有90％纤维母细胞存活。是否纤维母细胞比癌细胞在体外更能耐受超声作用？我们用了二种人肺癌细胞及一种人肺纤维母细胞，0.8 W／cm²连续波超声10秒、30秒、3分钟及10分钟，发现超声对不同类型细胞的杀伤作用未见明显差异。该结果提示，如果以癌细胞对超声杀伤作用敏感，而正常细胞对此比较耐受作为超声治疗癌症的基础之一，这样的超声治疗设计是缺乏依据的。

本实验发现细胞浓度是影响超声对细胞杀伤作用的重要因素之一，当细胞浓度低时（10⁷／L），0.8 W／cm²超声3分钟即可杀死98％SM<