【摘要】目的探讨FHIT基因转录表达异常在人肺癌发生、发展中的作用。方法应用nested RT-PCR方法对35例人非小细胞肺癌(NSCLC)组织、癌旁组织和远癌肺组织，10例肺良性病变肺组织以及4株肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常进行了研究。结果35例肺癌中14例肺癌组织存在FHIT转录表达异常，异常率为40％；在这14例癌组织转录本异常病例中，5例癌旁组织亦见转录本异常（35.71％，5／14）。远癌肺组织和肺良性病变组织均未见转录本异常。4株肺癌细胞株均检测到转录本异常。在鳞癌中FHIT基因转录本异常率（58.82％）显著高于腺癌(22.22％)(P＜0.05)。FHIT基因转录本异常与肺癌细胞的分化程度、P-TNM分期、原发肿瘤大小、肿瘤部位，以及患者年龄等均无明显关系（P＞0.05）。结论本研究结果表明在NSCLC中存在FHIT基因转录表达异常。FHIT基因异常主要发生在肺鳞癌中，且可能是肺癌发生的早期分子事件。

【中图分类号】R734.2；Q754

A study on transcript abnormalities of FHIT gene in human non-small cell lung cancer

CHEN JunZHOU QinghuaQIN YangSUN ZhilinSUN ZefangWANG YunLI LuQIN Jianjun （Department of Thoracocardiac Surgery, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China）

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of abnormalities in RNA transcript of FHIT gene in human non-small cell lung cancer(NSCLC). MethodsTranscript abnormalities of FHIT gene were detected in 35 cancer samples and their corresponding paracancer tissues and normal tissues, four lung cancer cell lines, and 10 lung tissues of benign pulmonary lesions as control by nested RT-PCR. ResultsFourteen of 35 cancer tissues (40％) had abnormalities in RNA transcripts of FHIT. There were 5 paracancer tissues with transcript abnormalities of FHIT gene out of the 14 lung cancers with transcript abnormalities of FHIT gene, with an abnormality rate of 35.71％. All of 4 lung cancer cell lines had transcript abnormalities of FHIT gene. The aberrant rate of FHIT gene in squamous cell carcinoma tissues (58.82％) was significantly higher than that in adenocarcinoma tissues (22.22％) (P＜0.05). No relationship was found among the transcript abnormality of the FHIT gene and differentiated degree of the tumor cell, stages of the cancer, size of the primary tumor, location of cancer, and age of the patients (P＞0.05). ConclusionThe results show that there are transcript abnormalities of FHIT gene in NSCLC. FHIT transcript abnormality preferentially occur in squamous cell carcinomas, and it might be the early molecular phenomenon of lung cancer.

【Key words】Lung neoplasmsFHIT geneTranscript abnormalitynested RT-PCRDNA sequence

癌基因的激活和抑癌基因的失活在肺癌的发生中起重要作用，癌基因和抑癌基因在肿瘤发生、发展中的分子机理，一直是肿瘤学领域的研究热点。然而，现有的研究表明，以往发现和鉴定的癌基因和抑癌基因绝大多数仅在肿瘤的晚期出现基因的异常，即它们的改变多是肿瘤的晚期分子事件。因此，多年来人们一直在寻找新的、在肿瘤初期甚至在癌前期就有结构和功能异常的基因。1996年，Ohta等^［1］利用外显子捕获法发现的FHIT（fragile histidine triad, FHIT）基因可能就属于此类肿瘤抑制基因。

FHIT基因定位于人染色体3p14.2，全长约500kb，含10个外显子，其cDNA约1.1kb，编码由147个氨基酸组成的16.8ku蛋白质^［2］。FHIT基因结构上有两大特点：一是含有t(3；8) (p14.2；q24）易位断裂点，而t(3；8)染色体易位常与早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌相关^［3］；二是含有脆性部位FRA3B，而FRA3B又是人类基因组最常见的Apaphidicolin诱导的脆性部位^［4］。结构的特性决定了FHIT易发生基因异常。

现有的研究表明FHIT异常和众多肿瘤发生相关^［5］。目前关于FHIT基因对肿瘤作用的研究在不同肿瘤之间甚至同一肿瘤不同研究者的结果之间都存在着差异，支持和不支持其作为抑癌基因的观点并存。说明FHIT基因在肿瘤发生、发展中的作用尚有待更多和更深入地研究。为了探讨肺癌中是否有FHIT基因转录表达异常，FHIT基因转录表达异常与肺癌临床病理生理特征有何关系，以及肺癌中FHIT基因转录表达异常是否与肺癌的发生有关，本研究应用nested RT-PCR方法检测了35例人非小细胞肺癌(NSCLC)、10例肺良性病变肺组织以及肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常情况，现将结果报道如下。

1材料和方法

1.1标本来源人肺组织标本来源于华西医科大学附属第一医院胸心外科1999年4月至1999年7月手术的患者。肺组织离体后立即放入液氮保存。共收集35例肺癌标本，年龄25～80岁，平均59岁。男性28例，女性7例。鳞癌17例（低分化9例，中高分化8例；Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期5例），腺癌18例（低分化9例，中高分化9例；Ⅰ～Ⅱ期7例，Ⅲ～Ⅳ期11例）。其中伴有淋巴结或／和不同肺叶及远处转移者12例，不伴有转移者23例。每个肺癌病例取癌灶、癌旁（离癌灶2cm，肉眼不见癌）和远离癌灶肺组织。另收集10例肺良性病变肺组织标本作对照，年龄35～64岁，平均49岁。男性6例，女性4例，其中肺结核5例，肺炎性假瘤5例。所有病例均有病理学证据，肺癌病理分期采用国际抗癌联盟（UICC）1997年修订的分期标准。

肺癌细胞株：A549(人肺腺癌细胞)、SPAC-1(人肺腺癌细胞)和L_3-8 Lewis系由我校肿瘤研究所细胞分子生物学实验室提供。PLA-801D(人肺巨细胞癌细胞)系由中科院上海细胞生物学研究所提供。

1.2肺组织和肺癌细胞株总RNA的提取采用酸性酚—氯仿一步法^［6］。

1.3nested RT-PCR外引物：Exon 1-10 F 5′-CATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3′，R 5′-TCACTGGTTGAAGAA-TACAGG-3′；内引物：Exon 3-10 F 5′-TCCGTAGTGCTATCTACAT-3′，R 5′-CATGCTGATTCAGTTCCTCTTGG-3′；内参照β-actin：F 5′-GACTACCTCATGAAGATC-3′，R 5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′。本实验所用引物均在北京赛百盛生物工程公司合成。RT-PCR反应系统组成为：1×一步法RNA PCR缓冲液，5mmol／L MgCl₂，1μmol／L dNTPs，20U RNase抑制剂，2.5U RNA逆转录酶，2.5U Taq酶，0.4μmol／L引物和1μg总RNA，加入无RNA酶的dH₂O至总体积25μl。于PCR扩增仪内：50℃逆转录50分钟，94℃ 5分钟灭活逆转录酶。94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次。末次循环后72℃延伸7分钟。

先用外引物行RT-PCR，同时亦用β-actin引物作为内参照。第一次RT-PCR结束后，取外引物循环后的PCR产物2μl，作为内引物PCR循环的模板，其循环参数同第一次PCR循环参数。之后取PCR产物10μl用2％琼脂糖电泳鉴定，并同时电泳β-actin作为内参照。

1.4PCR产物的克隆和测序经nested RT-PCR扩增后的产物采用玻璃乳DNA分离法纯化回收。PCR产物的克隆应用PGEM-T Vector systems (Promega)，用氯化钙法转化宿主菌JM109。重组质粒DNA均采用碱裂解法提取，聚乙二醇沉淀法纯化。质粒DNA测序由北京赛百盛生物工程公司完成。

1.5统计学处理采用χ²检验，P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1肺组织总RNA鉴定肺组织总RNA采用酸性酚—氯仿一步法提取，纯化后测定260nm／280nm OD值，比值为1.8～2.0，说明无蛋白污染。经1％琼脂电泳鉴定见总RNA有清晰的28S和18S两条条带（图1），说明RNA无降解，无DNA污染。RNA样品溶于DEPC处理后的消毒dH₂O，－70℃保存备用。

图 1肺组织总RNA电泳图

Fig 1Agarose electrophoresis of pulmonary total RNA

Lane 1: Primary cancer tissue; Lane 2: Para-cancer tissue; Lane 3: Corresponding normal lung tissue; Lane 4: Lymph node tissue

2.2FHIT基因在人肺癌中的转录本表达经nested RT-PCR扩增后FHIT基因转录本片段大小为700bp，β-actin经RT-PCR扩增后片段大小为500bp，与理论值相符。在35例肺癌患者中，有14例发生了FHIT基因转录本的异常表达，转录本异常率为40％(14／35)。FHIT基因转录本异常在肿瘤组织中主要表现为经nested RT-PCR扩增的产物电泳后，肿瘤组织有正常大小的条带和异常大小条带并存，异常条带以小于700bp为主，多出现在300～400bp；在本组病例中有2例肿瘤组织仅出现异常的条带，未见正常大小条带；有一例转录本表现为完全缺失，而相应的远癌肺组织未见异常。35例患者的远癌肺组织和肺良性病变组织扩增均获得成功，且未见有异常条带存在，但在14例癌组织转录<