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Expression of multidrug resistance gene and its reversion by cyclosporine in non-small cell lung cancer
ZHANG Xiaochun, QU Fengsheng, YUE Changqing, YANG Xiuxun, HONG Shiqiang, XU Gongli. Cancer Research And Treatment Center, Shandong Province Hospital, Jinan, Shandong 250021, P.R.China
【Abstract】ObjectiveTo investigate relation between the multidrug resistance gene (MDR1) expression and chemotherapeutic response for non-small cell lung cancer (NSCLC) and to evaluate the effect of cyclosporine (CsA) on reversion of MDR1. MethodsCancer tissue specimens and peripheral blood samples were collected from 46 patients with NSCLC. MDR1 was amplified in total RNA extracted from cancer cell specimens and peripheral blood lymphocyte (PBL) by RT-PCR assay. According to the result of detection, some MDR1-positive patients were treated with CsA and anticancer drugs (reverse group), other MDR1-positive patients (positive control group) and MDR1-negative patients (negative control group) were treated with anticancer drugs alone. ResultsThe MDR1 positive rate of cancer cells was 65.2％(30／46), and of PBL was 58.7％(27／46); twenty-four cases were MDR1-positive both in cancer cells and PBL. The positive rate of patients with recurrence was 81.3％(26／32); of untreated patients was 28.6％(4／14); of patients with multi-cycle chemotherapy was 85.7％(24／28); of patients with non-chemotherapy was 33.3％(6／18). The differences were significant (P＜0.01). The response rate was 46.7％(7／15) in reverse group and 20％(3／15) in positive control group and 37.5％(6／16) in negative control group. There were no significant differences in the toxicities and immunity changes except for hematological toxicity and impaired liver function between reverse group and other groups. ConclusionRT-PCR examination of MDR1 expression is useful for predicting response to chemotherapy and prognosis in NSCLC patients. MDR1-positive is associated with poor prognosis. The reverse effect of CsA for expression of MDR1 requires further clinical study.
【Key words】Non-small cell lung cancerMultidrug resistant geneRT-PCRCyclosporine
This work was supported by a grant from Key Task Project of Science and Technology from Shandong Province Science Committee (to Xu Gongli)(1999BB1DBA2).
化疗在肿瘤治疗中占据着不可替代的重要地位，然而肿瘤细胞对于化疗药物的内在性和获得性多药耐药（multidrug resistance, MDR）却往往造成化疗失败［1］。寻求逆转MDR的高效、低毒的抗药调节剂研究已成为国内外肿瘤学基础与临床研究的热点。目前已确定十余类药物有比较确切的逆转MDR疗效，其中环孢菌素类药物、钙通道阻滞剂及激素类药物进入了临床试用，但多限于血液恶性肿瘤的应用。我们以46例非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者肿瘤组织细胞及外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte, PBL）为样本，利用逆转录多聚酶链反应(reverse transcription--polymerase chain reaction, RT-PCR)检测MDR1的表达，结合患者对化疗药物的反应，分析多药耐药基因MDR1与化疗疗效之间的关系；根据检测结果，在化疗同时给予环孢菌素A（cyclosporine, CsA），观察CsA的疗效、毒性及对免疫功能的影响。
1材料和方法
1.1病例选择全组男性30例，女性16例，年龄45～72岁，平均年龄56.6岁。全部患者均经临床及病理证实，鳞癌20例，腺癌14例，腺鳞癌7例，大细胞癌5例；32例为手术后或放化疗后复发，14例为ⅢB期和Ⅳ期的初治患者。所有患者均有可评价疗效的客观观察指标，KPS评分大于60分，预计生存期3个月以上，且无严重的心、肝、肾功能异常及明显化疗禁忌症。
1.2检测方法
1.2.1检测标本化疗前分别采取患者外周静脉血1?ml并以肝素抗凝，经支气管镜取肿瘤组织活检或转移淋巴结活检，制备成细胞膜完整的单细胞悬液。
1.2.2试剂MDR1 RT-PCR药盒为北京师范大学北京京师生物工程技术公司产品。
1.2.3.样品处理①从1ml抗凝外周血分离出白细胞，悬浮于25?ml生理盐水中；约1?mm×1?mm×1?mm的肿瘤组织匀浆后加100?μl生理盐水悬浮，取25?μl用于RNA提取；加100?μl裂解液A充分振荡，加入裂解液B 100?μl与50?μl氯仿，充分混匀，15?000?r／min下离心10?min；小心吸取上清50?μl，加60?μl预冷（－20℃）的异丙醇混合10?s；②15?000?r／min下离心10?min，去掉上清，短暂离心并彻底吸干残余液体；③80％乙醇离心洗涤一次，同前法除去液体，室温干燥3～5?min。
1.2.4扩增反应向样本管或阳性RNA管中加入20?μl MDR RTmix和1?μl Emix混匀，离心数秒，加2滴石蜡油，42℃保温30?min；按下列参数扩增35个循环：94℃／45?s，55℃／45?s，72℃／45?s。
1.2.5检测结果判定制胶：5?ml?50×TAE稀释至250?ml，0.4?g琼脂糖加20?ml?1×TAE熔化制胶；电泳：取10?μl扩增产物加于2％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察：同时出现548?bp和167?bp条带者为阳性，只出现548?bp条带则为阴性，若二种条带均不出现者表明模板提取过程中RNA发生降解，不能判断其阴阳性。
1.3治疗方法
1.3.1分组根据RT-PCR检测结果将患者分成2组，MDR1阳性组为A组，阴性组为B组。A组再随机分2组：A1组为CsA逆转实验组，A2组为观察对照组。
1.3.2化疗方案化疗药物有异环磷酰胺(ifosphamide, IFO)，表阿霉素(epirubicin, EPI)，顺铂(cisplatin, DDP)和诺维本(navelbine, NVB)，方案为IEP（IFO＋EPI＋DDP）或NP方案（NVB＋DDP）。上述方案至少治疗2周期，间隔21～28?d。A1、A2和B组均应用上述方案。A1组于化疗前24?h开始服用CsA，直至化疗用药结束，剂量为4?mg／kg，化疗间歇期停止服药。
1.4临床观察指标46例患者治疗前后详细观察并记录临床症状、体征改善情况及不良反应，给予血常规、肝肾功能、免疫功能及心电图等有关影像学（X线、B超、CT或MRI）检查。
1.5评价标准和数据处理按照WHO 1981年统一评价标准，疗效分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD）。毒性分为0～Ⅳ度。数据处理采用χ2检验。
2结果
2.1检测结果本组检测中未出现RNA降解者。46例患者中肿瘤细胞MDR1阳性表达者为30例，阳性率65.2％；阴性者16例，阴性率34.8％。PBL细胞MDR1阳性表达为27例，阳性率58.7％；阴性为19例，阴性率41.3％。24例患者表现为肿瘤细胞和PBL细胞MDR1均阳性。肿瘤细胞MDR1的表达与患者既往治疗、肺癌组织学类型间的关系见表1。
2.2临床疗效A1组获CR?2例，PR?5例，SD?6例，PD?2例，有效率为46.7％；A2组PR?3例，SD?7例，PD?5例，有效率为20％；B组CR?1例，PR?5例，NC?6例，PD?4例，有效率为37.5％。A1组与A2组的疗效虽然相差比较明显，但由于标本少，尚无统计学比较意义。B组疗效也高于A2组，但其差异无显著性。
2.3毒副反应由表2可见血液毒性在A1组较A2、B组重，肝功能损害(除胆红素)A1组明显高于A2、B组，而肾功能及心功能检查各组间无明显差别。消化道症状A1组略重于A2、B组；A1组部分患者应用CsA期间出现全身烧灼感、颜面部水肿，停用CsA后2或3?d消失。
2.4对免疫功能的影响表3显示A1组和A2组T细胞亚群和T4／T8值在化疗后比化疗前均有所下降，而A1组下降幅度较A2组大，但其差异无统计学意义。
