【摘要】目的:探讨尿沉渣DNA微卫星分析方法在中国人膀胱癌诊断中的应用价值。方法:首先选取分布于18条染色体上的60个微卫星位点对38例膀胱肿瘤病人的尿沉渣和相应病理组织的DNA进行微卫星分析，寻找覆盖病人最多的位点组合;然后以此组合对40例膀胱疾病病人和健康志愿者的尿沉渣进行了双盲分析,以验证此组合的特异性和可能的临床价值。结果:建立了一套由9个微卫星位点组成的诊断组合。59例膀胱癌中，86％（31/36）的癌组织和90％（53/59）的尿沉渣DNA在这9个位点中至少有一个位点发生异常；12例非膀胱肿瘤个体的尿沉渣DNA无一例发生改变；检出率与肿瘤分期、分级无相关性；而且，该组合与美国人报道的组合明显不同。结论:作为一种无创伤性手段，尿沉渣DNA微卫星分析对于膀胱癌的筛查和早期诊断具有一定意义；与美国报道的诊断组合的不同，反映了人种差异和可能的病因学差异。

中图分类号:R730.43;R737.14文献标识码:A

文章编号:1000－467X(2000)06－0512－05

Potential of microsatellite analysis in detection of

bladder cancer in the Chinese

ZHANG Jian－jun， FAN Zhen－bin, CHENG Shu－jun, et al.

Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences and

Peking Union Medical College, Beijing 100021, P.R.China

【 Abstract】 Objectives: To investigate microsatellite analysis of urine sediments and find the potential for using it in diagnosis of bladder cancer in the Chinese. Methods: Sixty microsatellites markers from 18 chromosomes were first tested in a penal of 38 bladder tumors and corresponding urine specimens. The markers with high informative rates and frequent alterations were finally selected to set up the diagnostic panel. The same study was performed on urine DNA from 40 individuals with or without bladder lesions in a blinded fashion to test the specificity and the possible clinical value of this method. Results: A panel consisting of 9 microsatellites for diagnosis was set up. Among the 59 cases of bladder cancer, 86％ (31/36) of tumor tissues DNA and 90％ (53/59) of urine sediments DNA showed alterations, at least, in one of the nine microsatellite markers, while the 12 non bladder cancer individuals had no changes at any of these loci. The result was not associated with grade or stage of the tumor. Notably, this panel is mostly different from that used for the American patients. Conclusions: Microsatellite analysis of urine is a usable non invasive method for early detection of bladder cancer in the Chinese. The distinction between this panel and that of American implied racial and possible etiological differences.

Key words: Microsatellite; Bladder neoplasms; Diagnosis;Racial difference

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，在中国其发病率占泌尿系恶性肿瘤的首位^[1]。膀胱镜检查能在直视下进行可疑病变的活检，是目前诊断膀胱癌的基本手段。然而，膀胱镜检查不仅是一种创伤性诊断方法，而且对设备技术要求较高，因此，限制了它在早期诊断和普查中的应用。有研究表明，尿中癌细胞的出现可能早于膀胱镜观察到的病变，而且由于癌细胞较正常细胞易于脱落，尿脱落细胞中有95％为癌细胞^[2]，这使得用尿沉渣分析诊断膀胱癌成为可能。尿脱落细胞学检查是膀胱癌无创性诊断最常用的手段，但其敏感性较低，很容易漏诊，对于分化差的肿瘤敏感性为60％左右，对于分化良好的肿瘤则不足20％^[2]。

图1微卫星电泳代表图片

N：淋巴细胞，即正常对照；U：尿标本；T：病理组织。箭头标明杂合性缺失（LossofHeterozygosity,LOH）的等位基因；星号标明肿瘤病人的尿沉渣中出现的新带，即移位（Shift）。病例6的肿瘤组织在D18S472位点有明显的杂合性缺失，而其尿沉渣在此位点却无异常。

肿瘤的发生、发展是一个多阶段、涉及多种遗传变异的过程。微卫星的不稳定和杂合性缺失是肿瘤的常见现象。DNA微卫星序列短，便于PCR扩增，而且与特定肿瘤有着良好的相关性，因而受到人们的关注。已有充分证据表明微卫星是检测肿瘤临床标本很有价值的标记物。Sidransky等报道，在头颈鳞癌病人的唾液，肺癌病人的痰中可以检查到微卫星的改变。Nawroz、Cespedes则分别用血清中DNA的微卫星分析检测出部分头颈鳞癌和非小细胞肺癌病人^[3，4]。Mao等通过尿液中脱落细胞的微卫星分析，对90％以上的早期膀胱癌病人及术后复发病人做出诊断，其中对部分病人的诊断比膀胱镜检提早了几个月^[5]。为探讨尿沉渣微卫星分析在中国人膀胱癌诊断中的可能价值，我们进行了研究。

1材料与方法

1.1临床资料和标本收集

本组66例膀胱肿瘤病人均为中国医学科学院肿瘤医院泌尿外科住院病人。非膀胱肿瘤组12人，5人为健康成人志愿者，6人为膀胱良性病变患者，另有1例肺癌病人，临床资料见表1及表2。各病例均有病理检查确诊。分别收集膀胱肿瘤病人的新鲜病理组织，膀胱肿瘤病人及非膀胱肿瘤个体的外周血、晨尿（膀胱镜检查前或检查后两周取尿），离心分离外周血淋巴细胞及尿沉渣细胞，－80℃冻存备用。

1.2DNA制备

以酚－氯仿法常规制备上述各类标本的基因组DNA。用显微切割法纯化9例病人（见表1中＊）相应石蜡切片的肿瘤组织并制备DNA，方法参见文献^[6]。

1.3微卫星扩增及结果分析

方法参见文献^[5]，代表图片见图1。

2结果与讨论

首先，我们采用Mao等报道的13个微卫星位点^[5]对36例膀胱癌病人、2例内翻性乳头瘤病人的肿瘤组织和相应尿沉渣的DNA进行微卫星分析。结果除少数位点有一定比例异常外，多数位点在所研究的人群中因杂合度低或发生异常的病例少而不适于做诊断标记。利用Mao等报道的位点组合仅能对不到50％的病例做出诊断，与国外的报道相去甚远（资料未显示）。

此后，我们把研究范围扩大到18条染色体上的60个微卫星位点，经过筛选，最终建立了一套9个位点的组合（见表1、2）。36例膀胱癌中，86％（31/36）的癌组织DNA和86％（31/36）的尿沉渣DNA在这9个位点中至少有一个位点发生异常；2例内翻性乳头瘤中，有1例的瘤组织和尿沉渣检测到异常（见表1）。

表1回顾研究的临床资料及微卫星分析结果

注：病例序号表示实验顺序。标＊的病例的手术切除组织在我们所选的60个微卫星位点均无改变，为排除正常组织混杂，我们对其石蜡切片进行了显微切割纯化肿瘤组织并制备DNA，进行微卫星分析。表中结果为显微切割后的分析结果。NA:不能实施;ND:未做;U:尿；T：组织；NI：无信息；●：杂合性缺失（LOH）；★：移位（Shift）。－：杂合性保留（Retention）。

表2双盲研究的临床资料及微卫星分析结果

注：病例序号表示实验顺序。NA:不能实施;ND:未做;U:尿；T：组织；NI：无信息；●：杂合性缺失（LOH）；★：移位（Shift）。－：杂合性保留（Retention）。为进一步探讨该位点组合的特异性和在临床诊断中的实用价值，我们又对40例膀胱疾病和健康志愿者的尿沉渣DNA进行了微卫星双盲分析（见表2）。结果在23例膀胱癌中有22例（96％）的尿沉渣中检测到异常，3例内翻性乳头瘤病人的尿液也发现有微卫星改变，在脂肪瘤、神经纤维瘤和12例非膀胱肿瘤个体尿沉渣中未检测到改变（见表2）。至此，在进行了尿沉渣微卫星分析的59例膀胱癌中，90％（53/59）的病例可被此位点组合检测出阳性结果，12例非膀胱肿瘤个体则无一查到异常改变（见表1、表2）。这表明尿沉渣DNA微卫星分析敏感、特异，对于膀胱癌的诊断具有实际应用价值。另外，此位点组合对于较常见的膀胱内翻性乳头瘤也有一定诊断价值。而对于神经纤维瘤和脂肪瘤等其它少见的膀胱肿瘤，由于病例数较少，尚难定论。