【摘要】目的:获取较纯的微量胃癌细胞并检测p53基因的突变。方法:在显微镜下,直接分离出胃癌组织中微小癌灶内细胞,并应用单链构象多态(SSCP)技术分析该微量癌细胞中p53基因的突变。结果:在171例胃癌组织的石蜡标本中,有70例获得可靠结果,包括6例早期胃癌和64例进展期胃癌,该方法总成功率为41.0％。结论:显微分离细胞技术十分有利于观察癌前病变、原位癌及浸润癌的基因变化；该方法直接证明早期胃癌细胞中p53基因发生了突变。

中图分类号：R735.2文献标识码：A

文章编号：1000－467X(2000)06－0534－04

A microdissection technique for the molecular diagnosis of

p53 gene mutations in gastric carcinoma

SHAO Chun－kui， ZHU Zheng－gang， SU Zu－lan, et al.

Department of Pathology, The Third Hospital, Sun Yat－sen University

of Medical Sciences, Guangzhou 510630， P.R. China

【 Abstract】 Objective:To obtain pure gastric carcinoma cells for the molecular diagnosis of p53 gene mutations in gastric carcinoma. Methods:A microdissection technique was developed which consisted in picking out minute cell populations from paraffinembedded tissue sections under light microscopy and analyzing p53 gene mutations in the minute carcinoma cell populations by SSCP. Results:Of 171 cases of gastric carcinoma, 70 were analyzed successfully with a successful rate of 41.0％ , including 6 cases of early gastric carcinoma (EGC) and 64 cases of advanced gastric carcinoma(AGC). Conclusions:The microdissection technique proposed proved to be useful in gene studies of premalignant,in situ as well as invasive cancerous lesions and the method could directely demonstrate p53 gene mutation in EGC.

Key words: Microdissection techniq； p53 gene; Mutation; Gastric neoplasms

观察肿瘤细胞内基因变化有利于了解肿瘤发生发展的规律，并使分子诊断技术应用于临床成为可能^[1]。然而，在许多癌前病变和浸润性肿瘤组织中，基因变化的研究并没有取得普遍成功，限制因素之一就是组织标本中含有多种类型的正常细胞，包括上皮细胞、间质细胞、内皮细胞及各种炎细胞等，妨碍对癌细胞DNA进行精确分析^[2]。为了防止正常细胞干扰，获取较纯的胃癌细胞，我们建立了显微分离细胞技术，并检测了胃癌石蜡标本中p53基因突变。

1材料和方法

1.1材料

取瑞金医院外科1989年1月～1992年12月间的胃癌手术切除标本171例，标本展平固定于4％甲醛溶液中，常规石蜡包埋，苏木素-伊红（HE）染色，并进行常规病理诊断。其中有早期胃癌22例，进展期胃癌149例。E5、E6、E7、E8引物序列由上海第二医科大学检验系分子实验室惠赠，中科院细胞所合成，E4～9引物序列根据Ricevuto等人报道^[3]，GIBCO公司合成。PCR循环仪为P-E公司产品。鼠抗人p53抗体购自丹麦DAKO公司（工作浓度1∶100），ABC(鼠)试剂盒为美国Vector公司产品。

1.2显微分离细胞技术及PCR方法

根据Zhuang等人介绍的方法^[4]改良。

1.2.1显微镜下分离微量细胞：（1）将福尔马林固定、石蜡包埋的组织块，连续切片两张，切片厚5μm。（2）其中一张脱蜡、水化后进行常规HE染色，以便在显微镜下选取合适的视野。(3)另一张切片常规脱蜡水化。空气中凉干，凉干后伊红染色。（4）将伊红染色的切片放在显微镜下，用细针轻刮目的细胞，由于静电吸引作用，显微镜下可以看到细针头上粘附很多细胞，将细胞迅速移入已准备好的20μl消化液中（消化液组成：Tris-HCl，pH8.0，0.1mol/L；EDTA，pH8.0，0.1mol/L；1％Tween20及0.1mg蛋白酶K)。

1.2.2DNA提取：将上述含有目的细胞的消化液，放置37℃水浴箱内，过夜；PCR前煮沸5～10分钟，灭活消化液中的蛋白酶K，冷却后，6000～10000r/min离心，取5μl上清液DNA进行PCR扩增。

1.2.3多聚酶链反应（PCR）：（1）引物设计：人类组织细胞中p53基因组DNA全长约为20kb，共有11个外显子，p53的突变集中在5,6,7,8外显子，也是p53基因的高度保守区。根据此设计引物如表1。E4～9为一对巢式PCR引物，其序列与4和9外显子两侧的序列互补，其扩增片段为4～9外显子，长约1790bp。（2）第一轮PCR循环。PCR反应体系：一对巢式PCR引物（E4～9）各20pmol；上述DNA提取液5μl；10×buffer，5μl；MgCl₂，2mmol/L；dNTP，200μmol/L；TaqDNA多聚酶，1U（Promega产品）；用去离子水调至终体积50μl。反应条件为95℃变性5分钟，60℃退火40秒，72℃延伸1.2分钟，共30个循环。（3）第二轮PCR循环。PCR反应体系：一对外显子引物，各20pmol；第一轮PCR扩增产物5μl；10×buffer，5μl；MgCl₂，2mmol/L；dNTP，75μmol/L；TaqDNA多聚酶，1U（Promega产品）；用去离子水调至终体积50μl。各外显子反应条件如下：E5、E6：93℃变性3分钟，64℃退火40秒，72℃延伸70秒，共35个循环；E7、E8：93℃变性3分钟，60℃退火40秒，72℃延伸70秒，共35个循环。

1.3非同位素单链构象多态性（SSCP）分析

取第二轮PCR扩增产物5μl与等量变性上样液混匀，置沸水中5～10分钟，使PCR产物内DNA完全变性，迅速转移至冰上，5分钟后加样。12％非变性聚丙烯酰胺电泳，硝酸银染色观察结果。

1.4p53基因的表达

在显微分离法获得可靠结果的胃癌标本中，利用免疫组化法检测p53蛋白。采用微波修复抗原及常规ABC法。每次染色均采用TBS溶液代替第一抗体做阴性对照。结果判断：细胞核着蓝色者为阴性，呈现棕黄色者为阳性。反应范围以3级计分：阳性细胞＜10％者为（＋），10％～50％者为（＋＋），50％以上者为（＋＋＋）。阳性细胞必须结构清晰、定位好，着色明显高于背景。

1.5统计学处理

卡方检验或Fisher精确概率法。

2结果

2.1显微分离胃癌组织并检测p53基因突变

为了获取纯的胃癌细胞，我们对胃癌组织进行了显微分离（图1～4）。由图中可以看出，在显微镜下，根据组织细胞形态，成功地将癌灶内细胞分离出来，避免了组织中间质细胞、炎细胞等正常细胞对癌细胞的污染，达到了获取纯胃癌细胞DNA的目的。同时分离同一切片中的正常胃粘膜细胞作为对照。

图1粘膜内胃癌组织HE（4×10）

2粘膜内胃癌经显微分离后HE（6.3×10）

3浸润性胃癌组织HE（10×10）

4浸润性胃癌经显微分离后HE（10×10）

利用上面描述过的方法，对获得的癌细胞DNA及正常胃粘膜细胞DNA进行了两次PCR，图5是PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。每一例标本占有二个泳道，一为组织切片中正常胃粘膜DNA扩增产物产生的条带，标记为N(normal)；另一泳道为切片中胃癌细胞DNA扩增产物产生的电泳条带，标记为C(carcinoma)。同一病例的胃粘膜和胃癌细胞来自同一张切片，这样在C泳道上出现的条带，如果与对应的N泳道上不同，即被认为是产生了突变，见图5说明。

图5显微分离后细胞DNAPCR-SSCP结果

N为正常粘膜细胞DNA扩增条带,C为癌细胞DNA扩增条带;相邻的N、C皆取自同一张组织切片。C₂示p53突变阳性。

图6胃癌组织中p53蛋白的表达（40×10）

利用显微分离和巢式PCR相结合的技术，逐个对4％甲醛固定、石蜡包埋的171例标本进行了p53外显子5、6、7、8的突变研究，有70例获得较满意的结果，总成功率为约41.0％。其中早期胃癌6例，占22例早期胃癌总数的27.3％；进展期胃癌64例，占149例进展期胃癌总数的43.0％。

2.2胃癌组织中p53蛋白的表达

见图6说明，p53阳性反应物质均位于核内。在检测的70例胃癌标本中，有33例p53蛋白阳性，包括3例早期胃癌和30例进展期胃癌，阳性率为47.1％。

2.3p53基因突变与p53蛋白表达的关系(见表2，表3)

由表2中可以看出，部分早期胃癌中确实存在p53基因的突变，p53抑癌基因的突变极有可