中图分类号：R73－3文献标识码：A

文章编号：1000－467X(2000)06－0611－03

基因免疫(Geneticimmunization)是一门新兴的分子生物学和免疫学相结合的技术，它利用基因重组技术将编码抗原的目的基因通过一定方法导入体内，并表达相应的蛋白产物，从而诱导机体产生特异性免疫应答。与基因免疫同义或相近的术语还有DNA疫苗、核酸免疫、体细胞转基因免疫等。基因免疫研究目前主要活跃于感染性疾病防治领域，流感病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、结核杆菌、疟原虫等均已有DNA疫苗出现。

据观察，DNA疫苗产生的病毒蛋白的抗原性和自然感染时的情形非常相似,它能提供天然表位，所产生的抗体也为中和抗体，其保护作用明显优于灭活微生物和基因工程亚单位疫苗。基因免疫的优点很多，它能产生有效和完全的免疫应答，而一般不存在意外感染的危险。基因免疫不需在体外纯化蛋白质，因而相对省时、省力和廉价。DNA疫苗对热不敏感，储存和使用方便。DNA疫苗的应用具有很好的可控性，其诱生的免疫反应的强度和方向性，可通过改变接种方法和部位、质粒中的免疫刺激序列以及细胞因子和共刺激分子基因的同时使用等进行调整^[1]。

近年来，在利用基因免疫技术制备抗肿瘤疫苗方面也有不少尝试。本文就基因免疫的发展、应用方法及其机制以及在抗肿瘤研究方面的进展作一综述。

1基因免疫研究的历史

基因免疫的发展大致可分为两个阶段，1993年以前是其发现和完善阶段，此后则着重于应用及其机制的理解。就某些重组体DNA进入动物机体细胞后也能表达这一现象来说，其发现已有十多年了^[2,3]。Wolff等1990年报道，将带有氯霉素乙酰转移酶（CAT）的载体pRSVCAT－DNA质粒或βgCATβgAmRNA等分别直接注入小鼠骨骼肌，并检测到了该基因在骨骼肌中的表达产物。据此推想，直接将编码抗原的基因导入人的肌肉组织内，可能也能产生与接种抗原性物质一样的免疫效果^[4]。随后，很多作者的结果进一步表明外源性克隆化的目的基因可以在活体细胞中表达蛋白质，这些蛋白质对机体而言是外源的，理论上就有可能诱导机体产生特异性免疫应答。

1992年Hu等将猴免疫缺陷病毒（SIV）env基因插入痘苗病毒基因组中，构建了能表达SIVgp120和gp32的重组痘苗病毒载体V－SE5，用皮肤划痕法接种于恒河猴。初次接种后7天出现低效价抗体。二次接种后，效价升高，至2～4周时达高峰，20周后下降至50％～90％，一年后仍可检测到抗体的存在。用淋巴细胞增殖法也可检测到Th细胞功能活化^[5]。1993年Fynan等将编码流感病毒血凝素H1或H7的cDNA片段插入CMV质粒的转录控制元件下游，构建了抗流感病毒的核酸疫苗，接种于小鼠和鸡以后出现了特异性的免疫应答^[6]。同年Wang等和Ulmer等分别制备出了HIVgp160基因和流感病毒A蛋白的DNA疫苗^[7,8]。至此，基因免疫获得成功。多种病原体的DNA疫苗相继问世。

2基因免疫的方法和机制

进行基因免疫通常首先是构建核酸疫苗的载体，常见者为质粒或病毒。Rsv－CAT,Rsv－Neo,MMTv－β－Gal等质粒均可应用，其共同特点是有能在真核细胞内起作用的启动子。启动子类型直接影响质粒DNA在机体内表达外源性蛋白水平，因而是DNA免疫应答的主要影响因素之一。据称源于CMV的启动子调节功能最佳，源于Rsv的启动子功能亦较强，SV40启动子功能最弱。有的基因免疫利用目的基因自身的启动子元件也能诱导有效的免疫应答。例如HBVDNA免疫，用HBsAg基因自身的启动子取代CMV(pHBV－S2.S),在C57Bl/6小鼠可诱导产生高效价的抗体。此外，质粒DNA含有以CpG为核心的回文结构：5′－NTCGNA－3′或者5′－NACGTN－3′往往也是必须的，其作用可能类似于传统免疫方法中的佐剂^[9]。

目的基因的形式大多数为cDNA,也可是mRNA。与DNA相比，mRNA在体内存在的时间短，不会整合到细胞基因组，故风险极小。这对于某些具有转化潜能的肿瘤抗原来说尤为重要，避免了持久表达招致正常细胞癌变的可能。

基因免疫的接种方法主要是肌肉注射和基因枪皮肤轰击，也可选用静脉注射或皮肤粘膜下注射。肌肉注射一般选择骨骼肌，也可用心肌。基因枪技术也叫微粒轰击技术，利用一种特殊装置，在氦气驱动下将吸附有DNA或mRNA的钙或金微粒轰击组织（通常是皮肤），造成损伤以达到基因转移的目的。Fynan等经过比较发现接种效果最好的是基因枪，其DNA用量仅为直接肌注的1/250～1/2500^[6]。

基因免疫的确切机制尚未完全阐明^[1]，其过程大致如下：进入机体局部的DNA被周围的细胞摄取（如肌细胞、组织细胞、APC细胞或其它炎症细胞），质粒进入核内进行转录并进一步在胞质中翻译成蛋白质；然后蛋白被蛋白酶复合体降解形成短肽片段，这些片段一部分被hsp70运至内质网，进一步与MHCI类分子结合，最终运输到细胞膜表面被CD8＋CTL细胞识别；另一部分短肽可以进入溶酶体内与MHCII类分子结合，运至细胞表面被CD4＋Th细胞识别。细胞在递呈抗原同时，若同一细胞或相邻细胞同时提供共刺激信号，则将有效地激活CD8＋或CD4＋T淋巴细胞。同时，合成的蛋白可以通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，从而以天然折叠形式被B淋巴细胞识别，B淋巴细胞活化后产生中和抗体。在抗原递呈方面，由于肌细胞MHCI类分子表达量很低，而且缺乏MHCII类抗原以及B7－1/B7－2等共刺激分子，其作为APC的地位一度受到怀疑。Ulmer等最近证明转染肌细胞表达抗原足以激活机体的有效免疫^[10]。其它细胞也可从肌细胞获得传递的抗原并进行递呈，引起免疫应答。作为APC的树状突细胞可以摄取肌细胞释放的外源性抗原，也可以直接被外源性基因所转染。在基因枪接种途径中，表皮内的郎格罕氏细胞起抗原递呈作用，而上皮细胞本身也可进行抗原递呈。

3抗肿瘤研究

基因免疫抗肿瘤的明显优势在于能诱导出较强的细胞免疫应答，而且据称，内源性表达的肿瘤特异性蛋白片段在细胞内降解后产生的多肽可能模仿了病毒蛋白的抗原递呈过程，打破了免疫耐受并产生肿瘤特异性的免疫反应。这为抗肿瘤DNA疫苗的研究带来兴奋。

抗肿瘤基因免疫选用的抗原可以是组织特异性自身抗原或肿瘤相关抗原。例如，免疫球蛋白（Ig）和TCR可变区基因能产生抗独特型抗体，可用于淋巴瘤和白血病治疗；编码CEA和编码HERB－2/neu的表达质粒可分别用于结肠癌和乳腺癌；胚胎基因若在肿瘤中表达亦可考虑用于DNA疫苗，如编码HLA－A1的质粒可使HLA－A1型的黑素瘤病人能产生直接与黑素瘤抗原进行反应的CTL；SV－40和HPV16等肿瘤相关病毒的某些序列可用作相关肿瘤的DNA疫苗^[11,12]。此外，突变的癌基因或其片段如ras等也可用作基因疫苗^[26]。

3.1淋巴瘤

淋巴瘤细胞表面的Ig独特型是基因免疫治疗的理想靶的。Ig独特型来自基因重排，由重链和轻链的可变区基因所决定。其突出的个体化特征正好满足了抗肿瘤疫苗的特异性的需要。Ig独特型基因免疫如果可行,个体化疫苗的制备将变得非常简便。1993年Watanabe等报道了体内转染人免疫球蛋白可变区基因对小鼠的免疫效应^[13]。HumKv325胚系K轻链可变区基因插入哺乳类表达载体pREP7构建出pREVk3。肌注或皮下注射pREVk3的小鼠均可产生相应的抗体，和编码IL－2的表达载体共注射后，抗体效价增加5倍并诱发局部迟发性变态反应。Tenovus等报道，给B细胞淋巴瘤模型小鼠肌注独特型DNA疫苗诱导出低水平抗独特型抗体，而和编码有IL－2或GM－CSF的质粒DNA共注射则可显著提高抗体水平，并诱导抗独特型T细胞的增殖^[14]。

后来，Syrengelas等报道独特型基因免疫能使小鼠对B细胞淋巴瘤产生保护性免疫,使用Id/GM－CSF融合基因则免疫效果更好^[15]。Caspar等比较了源于同一淋巴瘤病人不同形式的独特型疫苗在小鼠的免疫效果，基因免疫毫不逊色于蛋白形式的免疫^[16]。

3.2结肠癌

癌胚抗原（CEA）是具有一定特异性的肿瘤相关抗原，由于其在大部分结肠癌中表达很高，而正常组织表达量很少，一直为肿瘤免疫治疗和基因治疗研究所关注。Conry等1994年报道，用编码CEA全长cDNA的质粒肌注免疫小鼠，观察到针对CEA的细胞和体液免疫反应，部分小鼠还产生了CEA特异的记忆T细胞。但在人体，由于正常结肠粘膜组织也表达少量的CEA，对其可能有耐受^[17]。

动物实验研究曾发现，利用重组痘苗病毒作为载体，免疫原性较弱的插入基因产物由于有强免疫原性的痘苗蛋白的存在，可产生较强的免疫反应。有鉴于此，Tsang等用重组痘苗载体构建了CEA的核酸疫苗rV－CEA^[18]。这种疫苗已经获准用于I期临床试验，晚期结肠癌病人应用后检测到了CEA特异的CTL前体细胞出现的证据，也观察到淋巴细胞增殖反应^[19]。

Irvine等对表达特异性肿瘤相关抗原β－gal的鼠结肠癌CT26.WT的研究表明，基因枪接种pCMV/β－gal质粒能防止肺部转移的发生，而且如有若干细胞因子的辅助，甚至能使已经发生的肺部转移瘤体积缩小、数目减少^[20]。

3.3乳腺癌

大约30％的乳腺癌病人有HERB－2/neu基因产物p185的过度表达。利用针