【摘要】目的:研究肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）多药耐药（multidrugresistance,MDR）基因表达蛋白P－糖蛋白（P－glycoprotein,P－gp）与转移能力的关系。方法:用链霉亲合素—生物素酶复合物（streptavidin－biotincomplex,SABC）免疫组化方法，检测57例HCC标本中P－gp,nm23/NDPK,ras/p21,Laminin(LN),E－cad的含量。结果：P－gp阳性百分数为52.6％,P－gp阳性和阴性表达者nm23阳性百分数分别为43.3％和77.7％（χ²=7.1,P＜0.01）,ras阳性百分数分别为76.7％和44.4％（χ²=6.23,P＜0.05）,LN阳性百分数分别为23.3％和33.3％（χ²=0.7,P＞0.05）,E－cad阳性百分数分别为60％和44.4％（χ²=1.38，P＞0.05）,侵袭转移率分别为70.0％和40.7％（χ²=4.94，P＜0.05）。结论:肝细胞癌P－gp高表达与癌细胞侵袭能力增强相关；与nm23、ras癌基因表达改变有关。

中图分类号：R735.7文献标识码：A

文章编号：1000－467X（2000）06－0561－04

Relationship between P－ glycoprotein and metastatic potential

in hepatocellular carcinoma

XIAO En－hua, LI Jin－qing, ZHANG Ya－qi, et al.

Department of Liver and Bladder, Cancer Center, Sun Yat－sen University

of Medical Sciences, Guangzhou 510060, P.R.China

【 Abstract】 Objective:Whether the phenotypes of drug resistance and metastatic activity in cancer are dependent on each other or not is controversial. We studied the relationship between P－glycoprotein and metastatic activity in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods:Fifty－seven histologically verified HCC specimens were obtained. SABC immunohistochemical staining with monoclonal antibody against human P－gp, E－cad, Laminin, and with multiclonal antiboly against human NDPK, ras/p21, respectively, were used to observe the P－gp, E－cad, Laminin, NDPK, p21 in all specimens. Results:nm23/NDPK,ras/p21, Laminin and E－cad positive rate in P－gp(＋ ) specimens were 43.3％ ,76.7％ , 23.3％ and 60％ , while in P－gp(－ ),were 77.7％ ,44.4％ , 33.3％ and 44.4％ , respectively(χ² value was 7.1, 6.23, 0.7 and 1.38, P value was<0.01,< 0.05,>0.05 and ＞0.05, respectively). The incidence of invasiveness and metastasis in P－gp(＋ ) was 70.0％ ,in P－gp(－ ) was 40.7％ (χ²=4.94,P＜ 0.05). Conclusion:Our data suggest that overexpression of P－gp in HCC may covariate with the phenotypes of both enhanced metastasis and low nm23 expression and high ras expression.

Key words:Liver neoplasms; P－glycoprotein; Immunohistochemistry

肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）化学药物治疗（简称化疗）常因多药耐药（multidrugresistance,MDR）的产生而导致失败。多药耐药基因及其表达产物P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）在MDR中起重要作用,而且可作为预后的观察指标^[1]。HCC患者死亡的主要原因是癌细胞浸润转移复发。从分子水平来看，肿瘤的浸润转移是由多种基因参与调控的，如nm23,ras,Laminin(LN)，E-cad等^[2]。为探讨HCC耐药表型与转移能力的关系，我们采用链霉亲合素—生物素酶复合物（streptavidin-biotincomplex,SABC）免疫组化方法检测57例HCC标本中的P-gp,nm23/NDPK,ras/p21,LN,E-cad,现报道如下。

1材料与方法

1.1临床资料

手术病理证实的HCC57例，男51例，女6例。年龄24～70岁，中位年龄45.3岁。肿块直径3～5cm7例，＞5cm者50例。梁索型16例，索状腺样型9例，透明细胞型13例，未（低）分化型5例，实体型12例，硬化型和小细胞型各1例。Edmondson分级Ⅰ级8例，Ⅱ级30例，Ⅲ级19例。ChildA级46例，B级11例;OkudiⅠ级54例，Ⅱ级3例。肿块完全切除35例，姑息切除19例，未能切除仅活检3例。AFP阳性43例。

1.2免疫组化

鼠抗人P-gp，兔抗人nm23/NDPK,鼠抗人E-cad,鼠抗人ras/p21,兔抗人LN等一抗，生物素（biotin）标记羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G（IgG）,内源性亲合素（avidin）封闭液即A封闭液，内源性生物素（biotin）封闭液即B封闭液，SABC等试剂从武汉博士德公司购买。标本经甲醛溶液（10％福尔马林）固定，石蜡包埋制成5μm的切片，经60℃烤箱处理1h，用二甲苯脱蜡，乙醇逐级水化，免疫组化染色采用SABC法。用缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照(全部阴性)，用已知的阳性切片作为阳性对照(全部为阳性)。胞浆和/或胞膜呈棕黄色染色的细胞为阳性细胞。P-gp,nm23,ras等取5个有代表性的高倍镜视野计算阳性细胞数，平均阳性细胞数＞10％为阳性（图1）；采用Dorudi方法，肿瘤细胞染色程度与正常组织相近定为E-cad阳性^[3];采用orit等的判断标准即阳性染色范围超过肿瘤区基底膜50％为LN阳性^[4]，表现为癌巢边、癌细胞间质、汇管区呈棕黄色染色（图2）。实验采用盲法，由两人分别统计结果，不一致者，由两人共同确定。

1.3统计学处理

本研究采用χ²检验。

2结果

2.1肝细胞癌P-gp表达

P-gp阳性表达30例，占52.6％，P-gp阳性率在Edmondson分级中Ⅰ级25.0％（2/8），Ⅱ级56.7％（17/30），Ⅲ级57.9％（11/19）；梁索型50％（8/16），索状腺样型55.6％（5/9），实体型58.3％（7/12），透明细胞型46.2％（6/13），未（低）分化型80％（4/5）。

2.2P-gp表达与nm23/NDPK,ras/p21,LN,E-cad表达的关系

P-gp阳性者NDPK阳性率低于P-gp阴性者，而p21阳性率高于P-gp阴性者，两者有显著性差异；LN、E-cad阳性率在P-gp阳性阴性者之间无显著性差异。因此，P-gp变化与nm23/NDPK、ras/p21表达密切相关，而与LN、E-cad表达改变关系不大。详见表1。

2.3P-gp表达与浸润转移的关系

转移指血管内有肉眼或镜下癌栓、淋巴结转移、其它非肝脏器官组织的侵犯。P-gp阳性组浸润转移率70.0％（21/30），P-gp阴性组为40.7％（11/27）（χ²=4.94，P＜0.05）。

图1ras/p21在肝细胞癌组织中表达，阳性信号位于胞膜和胞浆，SABC法×400

图2LN在肝细胞癌组织中表达，阳性信号位于癌细胞间质，SABC法×400

3讨论

肝癌是一种严重危害人们健康的恶性肿瘤，化疗是其经典而且重要的治疗手段之一，但单纯化疗临床疗效常不理想，主要是存在多药耐药现象。耐药性的产生与下列因素相关^[1]：（1）多药耐药基因及P-gp表达增加；（2）多药耐药相关基因及多药耐药相关蛋白表达增加；（3）肺耐药相关基因及肺耐药相关蛋白表达增加；（4）谷胱苷肽及其转移酶表达增加；（5）拓扑异构酶表达下降；（6）肿瘤细胞DNA损伤修复能力及抗凋亡能力增强。本研究仅检测P-gp，57例HCC在未经其他治疗时，即有30例表现有耐药性，占52.6％。文献报道原发性肝癌P-gp表达可达75％^[5]，如再考虑其它耐药相关因素，则HCC耐药比例更大，说明HCC是一种高抗药性的肿瘤。本组资料显示HCCⅠ级肿瘤细胞中P-gp表达最低，随病理分级的升高有递增趋势，透明细胞型和梁索型耐药性较实体型和未分化型稍低；本组资料还显示：P-gp阳性的肿瘤细胞较P-gp阴性者更易发生浸润转移，两者有显著性差异。在实验性鼠肝癌研究中发现，P-gp表达与恶性进展相关^[6]，P-gp阳性的结肠癌也显示血管侵袭和淋巴结转移发生率高^[7]。均说明了P-gp过表达除涉及到耐药外，也是癌细胞生物学行为进一步恶化的指标。

肿瘤的浸润转移是一个多步骤、连续性的主动过程，大致可分为：（1）癌细胞间粘附能力下降，从原发癌脱落；（2）脱落的癌细胞与细胞外基质通过特异受体识别结合并相互粘附；（3）癌细胞粘附后，便释放多种水解酶类,使肿瘤细胞粘附的细胞外基质降解；(4)癌细胞以主动方式侵入循环管道，形成栓子；(5)在特定器官的毛细血管滞留并粘着，再次穿过血管壁并定居、增强，形成转移灶。这一过程由多种基因调控如nm23,ras,LN,E-cad等^[2]。

文献报道：nm23基因在肝细胞癌可抑制转移，使肝细胞癌转移潜能下降^[8]。我们的资料也显示肝细胞癌NDPK阴性者转移能力明显增强，与NDPK阳性者相比有显著性差异（结果另文发表），nm23还可引起myc基因表达，促进肿瘤细胞凋亡,并调节肿瘤细胞与微环境的反应，促