【摘要】目的：研究Flt3基因在不同类型、亚型白血病中mRNA表达、分布情况，以期阐明Flt3基因表达与疾病发生、发展的关系，探索Flt3基因作为白血病转归及预后指标的意义。方法：应用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法分离出外周血中原始细胞，采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR），检测Flt3基因在109例恶性血液病患者外周血中表达。结果：初治AML(急性髓细胞性白血病)中Flt3基因mRNA表达为91.4％;ALL（急性淋巴细胞性白血病）中表达率亦较高，为82.3％；在急性白血病的CR(完全缓解)病例中原Flt3阳性表达可转为阴性；而NR(未缓解)的患者则持续为阳性表达。CML(慢性髓细胞性白血病)中阳性表达为33.9％，仅见于急变期及加速期，在慢性阶段则无表达。6例CLL（慢性淋巴细胞性白血病）中的4例、4例MDS（骨髓增生异常综合征）中的2例表达Flt3。结论:Flt3基因有望在白血病诊治过程中成为标志性基因。

中图分类号：R733文献标识码：A

文章编号：10000－467X(2000)06－0589－05

Study on the expression of Flt3 gene in human

leukemias and its clinical significance

LI Dong

Department of Hematology,Nanjing Jiangbei People's Hospital， Nanjing 210048， P.R. China

GU Qing－ li， ZHU Wan－ ying， et al.

Jiangsu Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006, P.R. China

【 Abstract】 Objectives: To investigate the expression of Flt3 gene in leukemia and indicate the relation between the expression of Flt3 gene and the occurrence or the development of the disease. Methods: The separation method of the Percoll discontinuous density gradient was applied to isolate the blast cells in peripheral blood. RT－ PCR was used to detect the mRNA expressions of Flt3 in blast cells of peripheral blood from 109 malignant patients. Results: The high level of the Flt3 mRNA in primary AML blasts from 35 patients peripheral blood was 91.4％ with no apparent predominance of any of the M1～ M6 subtypes, Flt3 mRNA in ALL also was found at high level in 82.4 ％ . When the patients were in complete remission(CR), their expression could be changed from positive to negative. But the positive rates was continual if the leukemia cases were non-remission (NR). The positive rate in CML sample was 33.9％ which was attained merely to accelerated phase and blast crisis,whereas it was not found in chronic phase. Flt3 mRNA was detected in 4/6 cases of CLL and 2/4 cases of MDS. Conclusion:Flt3 gene will hopefully become a symbolic gene during the course of diagnosis and treatment in leukemias.

Key words:Flt3 gene; Leukemia; Gene expression; RT-PCR

Flt3基因是近年发现的早期造血生长因子受体基因,其与KL(干细胞生长因子)的受体C－kit、CSF-1（巨噬细胞集落刺激因子）的受体c-fms同属于第三族酪氨酸激酶基因家族成员，调控早期造血，其中Flt3正常表达时期较后两者更早。已有报道c-kit和c-fms在白血病中有表达^[1,2]。有关Flt3在白血病中的表达研究目前国内尚未见类似报道，为检测Flt3基因在中国人白血病不同类型、亚型白血病表达、分布情况。本文通过采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法直接分离出外周血中原始细胞，运用RT-PCR检测方法，检测了Flt3mRNA在109例恶性血液病病人的外周血中的表达，旨在研究在白血病中Flt3基因的表达、分布与疾病发生、发展的关系；探索Flt3基因作为白血病转归及预后指标的意义，在白血病的诊治中提出一种新的检测和评估方法。

1材料和方法

1.1临床病例和白血病细胞株

恶性血液病患者109例，其中AML(M₁～M₆)35例，ALL17例，CML47例，CLL6例，MDS4例；男58例，女51例；中位年龄37.5岁。并对6例急性白血病病人短期随访。对照组的外周血样本23例，包括献血员10例、非恶性血液病病人13例[ITP(特发性血小板减少性紫癜)7例、IDA（缺铁性贫血）5例、AA（再生障碍性贫血）1例]，以及5株白血病细胞株：原粒白血病细胞株KG-1，早幼粒白血病细胞株NB4，急性髓性白血病细胞株HL-60，慢性粒细胞白血病细胞株K562，淋巴性细胞株U937，以用作阴性及阳性对照。（由苏州医学院附属第一医院、江苏省血液研究所白血病研究室提供）。

|1．2试剂

1．2．1细胞分离液Percoll(Pharmacia公司)，DextranT-500(Pharmacia公司)，SIP(贮存液)：9份Percoll加1份1.5mol/LNaCl作为贮存液。60％（V/V）SIP：用pH7.4去Ca^2＋、Mg^2＋之Dulbecco缓冲液稀释[SIP∶缓冲液（V/V）=6∶4]；50％（V/V）SIP∶用pH7.4去Ca^2＋、Mg^2＋之Dulbecco缓冲液稀释[SIP∶缓冲液（V/V）=5∶5]；1.5％DextranT-500∶DextranT-5001.5g溶于pH7.4去Ca^2＋、Mg^2＋之Dulbecco缓冲液100ml，置冰箱待用。

1.2.2RNA制备试剂：溶液D（4mol/L异硫氰酸胍，25mol/L柠檬酸钠（pH7.0），十二烷基肌氨酸钠,β-巯基乙醇），醋酸钠，水饱和酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇，DEPC(Gibco-BRL)。

1.2.3RPMI-1640培养基：按供应商（Gibco-BRL）推荐的方法配制，加入终浓度为10％的新生小牛血清（NCS，上海实生公司），经0.22μm滤膜过滤。

1.2.4逆转录反应试剂：六随机引物（Sangon）及RNA酶抑制剂（上海华美）AMV逆转录酶（Promega），5×合成第一链缓冲液（Promega），10mmol/LdNTPs（上海生工公司）。

1.2.5PCR反应试剂：10×PCR缓冲液，25mmol/LMgCl₂,TaqDNA聚合酶（Sangon）。

1.2.6标准分子量：PBR322DNABsuRI(HaeⅢ)，MBI公司（Fermentas）。

1.2.7Flt3、β-actin、abl基因引物由上海生工公司合成。

Flt3（366bp）

R5：5’－TGTCGAGCAGTACTCTAAACA－3’(nt1487～1507)

R6：5’－ATCCTAGTACCTTCCCAAAACTC－3’(nt1831～1852)

β-actin(210bp)sense：5’－CTTCCTGGGCATGGAGAC－3’

antisense：5’－CGCTCAGGGAGGAGCAATGAT－3’

abl(185bp)sense：5’－TTCAGCGGCCAGCATCTGACTT－3’

antisense：5’－GACCCGGAGCTTTTCACCTTTAGTT－3’

1．3实验方法

1．3.1细胞分离：采用血细胞Percoll不连续密度梯度分离法^[3，4]，分离出外周血中的单核细胞、淋巴细胞、粒细胞。将分得的单核、淋巴和粒细胞用pH7.4去Ca^2＋、Mg^2＋之Dulbecco缓冲液洗2～3次，除去残余的Percoll，计数，涂片，分类。

1.3.2RNA制备:采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA^[5]。抽提的RNA用DEPC－H₂O溶解,实验选用样本为经紫外分光光度计测定其RNA溶液A260/A280＞1.8，且经RNA酶消化后在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外灯下观察未发现有RNA及其它条带存在。－20℃保存备用。

1.3.3逆转录反应：标本总RNA2μg，六随机引物100ng，加DEPC处理水至20μl，72℃变性5分钟，另加5×合成第一链缓冲液8μl，10mmol/LdNTP1μl，RNA酶抑制剂RNasin50U，10mmAMV10U，总逆转录体系40μl，37℃反应60min，4℃保存。

1.3.4PCR反应：（按BoehringerMannheim厂商试剂盒方法稍加修改）反应体系50μl，取cDNA10μl，分别加入40pmol引物R5和R6，及β-actin的sense链和antisense链引物,10×PCRbuffer5μl，MgCl25μl，10mmol/LdNTPs1μl,TaqDNA聚合酶2U。PCR反应时间为：预热94℃5min；随后58℃45s、72℃60s、94℃30s，共35个循环；72℃延伸10min钟；4℃保存。

1.3.5RNA质量监测:样本采用abl引物扩增^[6]，若只有一条185bp的条带，表明该模板RNA是完整的。

1.3.6统计学检验：采用卡方检验，四格表精确概率检验法。

图1细胞株Flt3基因的表达

M:Marker,1:HL－60,2:K562,3:U937,4:NB4,5:KG－1

图2PCR灵敏度检测

1～10:NB4细胞RNA20～2－9

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