【摘要】目的：为了探讨EB病毒（EBV）中LMP1的致瘤机制，对鼻咽癌LMP1激活重要的核转录因子NF－κB的机制进行了研究。方法：①以LMP1阴性的鼻咽癌细胞系HNE2及表达载体（pSG5）的鼻咽癌细胞系HNE2－pSG5为对照，采用免疫共沉淀－Western－blotting方法在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2－LMP1中证实LMP1与TRAF2是否直接结合形成免疫共沉淀复合物；②在HNE2－LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒或不同剂量TRAF2显性负性突变体(TRAF2Δ6～86)表达质粒，以NF－κB报道基因方法确定LMP1是否通过TRAF2活化NF－κB；③将LMP1(1～231)（CTAR2缺失区）或LMP1Δ187～351(CTAR1缺失区)及不同剂量TRAF2Δ6～86瞬时导入HNE2中以证实LMP1CTAR1或CTAR2是否介导了这种效应；④以转染或未转染TRAF2Δ6～86的HNE2－LMP1细胞系为材料，应用免疫共沉淀－Western－blotting方法，确定TRAF2Δ6～86是否竞争性抑制TRAF2与LMP1结合。结果：①在HNE2－LMP1中LMP1与TRAF2形成复合物沉淀，而HNE2－pSG5和HNE2为阴性。②在HNE2－LMP1细胞系导入TRAF2表达质粒，NF－κB活性增高20倍，而导入不同剂量TRAF2Δ6～86表达质粒时，随着剂量增大，NF－κB活性递减。③TRAF2强烈抑制LMP1(1～231)活化NF－κB，而仅部分抑制LMP1Δ187～351活化NF－κB。④TRAF2Δ6～86竞争性抑制TRAF2与LMP1结合。结论：在鼻咽癌中LMP1通过TRAF2而激活NF－κB，其中LMP1的CTAR1区主要介导了这种效应。这为我们进一步从信号传导通路来探讨LMP1的致癌机制提供了新的线索。

中图分类号：R739.3文章标识码：A

文章编号：1000－467X（2000）06－0517－04

Epstein-barr virus-encoded latent membrane protein 1 activates NF-κ B via

a mechanism involving TRAF2 in nasopharyngeal carcinoma

WANG Cheng-xing, LI Xiao-yan, CAO Ya, et al.

Cancer Research Institute of Hunan Medical University, Changsha 410078,P.R.China

【 Abstract】 Objective: Our recent studies show the strong relationship between NF-κ B activation mediated by LMP1 and nasopharyngeal carcinoma (NPC) neoplastic phenotype. We are trying to identify the mechanism involved. Methods: A stable transfectant cell line established by introducing LMP1 cDNA into HNE2 cells,HNE2-LMP1,was used as cell model. The association of LMP1 with TRAF2 was detected with immunoprecipitation-Western-blotting in the HNE2-LMP1; the role of TRAF2 in LMP1, LMP1(1～ 231) or LMP1Δ 187～ 351-mediated NF-κ B activation was evaluated using TRAF2 dominant negative mutant TRAF2Δ 6～ 86 with reporter gene analysis; blocking of the association of TRAF2 with LMP1 by TRAF2Δ 6～ 86 was investigated by immunoprecipitation-western blotting. Results: TRAF2 was bound and coprecipitated to LMP1 in an HNE2-LMP1 cell line. A dominant negative TRAF2 inhibits NF-κ B activation from LMP1 and competes with TRAF2 for LMP1 binding. TRAF2Δ 6～ 86 inhibits NF-κ B activation mediated by LMP1(1～ 231) by more than 75％ but inhibits NF-κ B activation through LMP1Δ 187～ 351 by less than 40％ . Conclusion: These data implicate TRAF2 aggregation in NF-κ B activation by LMP1 and provide an experimental basis for our study beginning from the signal transduction pathway for elucidation of the mechanism of LMP1 carcinogenesis.

Key words:Nasopharyngeal neoplasms;Latent membrane protein 1;Tumor necrosis factor receptor associated factors 2;NF-κ B

EB病毒是一种与多种肿瘤发生密切相关的DNA致瘤病毒，除了与鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、移植术后淋巴瘤、传染性单核细胞增生症等病有关外，最近的进展证明EB病毒还与肺癌、胃癌、甚至与乳腺癌等多种肿瘤的发生有关。目前的研究发现，EBV编码的重要致瘤蛋白LMP1类似肿瘤坏死因子受体家族CD40，通过激活细胞内的信号传导通路而参与肿瘤的发生与发展^[1]。

转录因子NF-κB是近年来研究的热点。在LMP1所介导的信号传导网络系统中，它处于信号传导枢纽。作为重要的转录调控因子，NF-κB被LMP1激活后，调节很多靶基因表达，这些基因参与细胞增殖、转化、分化、凋亡、免疫反应等多种生物学过程，因而与肿瘤的发生与发展有着密切关系^[2]。

新近，我们的工作证实在鼻咽癌中LMP1能高水平持续激活NF-κB，且与细胞恶性表型密切相关^[3]。在此基础之上，进一步研究LMP1如何激活NF-κB，确定何种效应分子介入了这种活化，以及探索其机制，将为深入探讨鼻咽癌中LMP1激活NF-κB的分子机制提供有意义的实验依据。

LMP1在淋巴细胞中介导的细胞内信号传导通路证实^[1]LMP1通过与肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor associated factors,TRAFs）或肿瘤坏死因子受体死亡结构域蛋白（tumor necrosis factor receptor associated death domain protein,TRADD）结合,促进IκB磷酸化，从而激活NF-κB。其中在LMP1羧基末端有两个结构域与功能密切相关，一个是位于194～231位氨基酸的CTAR1(carboxy terminal activating region1)；另一个是位于351～386位的CTAR2。CTAR1通过聚集TRAF1/TRAF2/TRAF3，激活大约25％NF-κB活性，而CTAR2通过聚集TRADD/TRAF2活化75％NF-κB。由于TRAF2内含锌指结构为NF-κB活化所必需^[4]，而且CTAR1及CTAR2活化NF-κB皆为TRAF2所介导，因而它可能是鼻咽癌中LMP1激活NF-κB中的关键效应分子。由此，我们将以TRAF2为切入点，在鼻咽癌中探讨LMP1是否通过与TRAF2结合而有效地激活NF-κB。

1.1材料

1.1.1细胞系：鼻咽癌细胞系HNE2是本所建立的EB病毒阴性的低分化鳞癌细胞系，LMP1阴性^[5],我们以转染空白载体为对照，分别将野生型B95-8来源的全长LMP1cDNA和新霉素选择标志Neo基因用电穿孔法共同导入HNE2中，G418筛选，挑单个克隆，鉴定，建立稳定表达LMP1鼻咽癌细胞系：HNE2-LMP1（野生型）及其空白载体的鼻咽癌细胞系HNE2-pSG5(空白载体型)。

1.1.2质粒：（1）LMP1及突变体表达质粒：(B346-FlAG-LMP11-386（野生型LMP1）,(B462-FlAG-LMP11-386△187～351(CTAR1缺失型),③B467-FlAG-LMP1(1～231)(CTAR2缺失型),④pSG5-空白载体:由美国BrighamandWomen'sHospital,DrKennethMlzumi馈赠。（2)TRAF2及其显性负性突变体表达质粒:①PCR2FL-TRAF2（1-501），由日本JuntendoUniversityDr.NiroyasuNakano馈赠;②PCR2FL-TRAF2Δ6～86由美国BrighamandWomen'sHospital,DrKennethMIzumi馈赠。（3）NF-κB报道基因质粒（pGL2-NF-κB-luc）由美国国立癌症研究院李建建博士馈赠。将质粒按常规方法转化大肠杆菌TG1，纯化质粒，酶切鉴定后，测定DNA浓度，置4℃保存。

1.1.3抗体与试剂:LuciferaseAssaySystem购自美国Promega公司，PlasmidPurificationKit购自美国QIAGEN公司,LipofecTAMINE购自美国生命技术公司（GibcoBRL）。

1.2方法

1.2.1免疫共沉淀-Westernblotting:按ImmunoCATCHERkit说明操作，以B95-8细胞为阳性对照，将LMP1抗体与HNE2-LMP1、HNE2-pSG5、HNE2细胞裂解物温育，形成LMP1抗原-抗体复合物，12％SDS-PAGE凝胶电泳，电转移至硝纤膜，再与TRAF2兔多克隆抗体温育12h，抗兔IgG-HRP温育1h，DAB显色法检测棕黄色条带。

在鼻咽癌活检组织中LMP1与TRAF2信号分子共表达于癌细胞的胞膜及胞浆同一部位的基础上，进一步用免疫共沉淀-Western-blotting方法探讨在鼻咽癌细胞系中LMP1是否结合TRAF2发挥作用。

以B95-8细胞为阳性对照，在HNE2-LMP1、HNE2-pSG5及HNE2细胞系中，应用免疫共沉淀-Western-blotting方法，先用LMP1抗体免疫共沉淀下与之作用的信号分子，再用TRAF2抗体进行Western-blotting杂交分析，以证实LMP1是否与TRAF2作用。

1.2.2LipofectTAMINE介导的瞬间转染:按LipofecTAMINE转染说明书，转染前24小时将细胞种植于6孔细胞培养板中,待细胞生长至50％～80％的融合度时弃培养基。取2μgDNA稀释到100μl无血清培养基中，加入10μlLipofectamine，混匀后室温静置15min。加入800μl完全培养至DNA-Lipofectamine混合物中，混匀。培养细胞经D-Hank's液漂洗后，再将DNA-lipofectamine混合物加入，混匀。5％CO₂培养箱37℃培养3h后，用D-Hank's液洗涤细胞，加入完全培养基继续培养直到收获。

图1鼻咽癌细胞系中TRAF2表达的免疫共沉淀Western-blotting分析1：Bq5－8;2:HNE2-LMp1;3:HNE2-PSG5;4:HNE2

图2鼻咽癌细胞系中LMP1通过TRAF2活化NF-κB的报道基因分析