【摘要】目的：探讨AnnexinI表达与肺癌及细胞转化的关系。方法：Western印迹、Northern印迹检测永生化人支气管上皮BEP2D细胞及α粒子照射转化后BEP2D细胞中AnnexinI在mRNA和蛋白质水平的表达，细胞免疫化学检测AnnexinI在BEP2D细胞中的分布。Western印迹检测肺癌病人正常组织与肿瘤组织中AnnexinI蛋白质的表达。结果：AnnexinI在α粒子照射转化后BEP2D细胞中mRNA和蛋白质水平上的表达光密度均为永生化人支气管上皮BEP2D细胞的1.5倍；AnnexinI在BEP2D细胞中分布于胞浆及细胞膜。本研究收集了8例肺鳞癌、4例肺腺癌病人的肺肿瘤组织及正常组织，AnnexinI在肺癌组织中的表达明显高于正常组织（P＜0.01），AnnexinI在肿瘤组织中表达的光密度与正常肺组织之比为2.7。结论：AnnexinI在肺癌组织过表达，表明AnnexinI可能与肺癌及细胞恶性转化的发生发展有关。永生化及α粒子照射恶转BEP2D细胞为进一步研究AnnexinI在恶性转化中的作用提供了良好的模型。

中图分类号：R734.2;R730.231文献标识码：A

文章编号：1000－467X(2000)06－0507－05

Overexpression of Annexin I in transformed BEP2D cells by

α－ particles and lung cancer tissues

PENG Shao－hua， WU De－chang， LI Gang， et al.

Department of Molecular Toxicology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, P.R.China

【 Abstract】 Objective: To evaluate the expression of Annexin I, a calcium-dependent phospholipid binding protein, in relation to lung cancer development and progression, and malignant transformed human bronchial epithiliar cells (BEP2D) by α －particle. Methods: In this study the expression level of Annexin I had been determined by Western blot and Northern blot. The distribution of Annexin I in BEP2D cells was studied by cellular immunochemistry. Results: Northern blot and Western blot showed that the expression level of Annexin I was moderate in immortalized BEP2D cells, but was overexpressed in α－particles transformed BEP2D cells. The amount of expression in transformed BEP2D cells is 1.5 times as high as in the immortalized ones both in mRNA and protein levels. In BEP2D cell Annexin I distributes on membrane and in plasma, but not in nucleus. However, no difference of distribution between immortalized BEP2D cells and α－particle transformed BEP2D cells was observed. Furthermore, the expression of Annexin I in nontumorous and tumorous lung tissues was determined, which were collected from 4 lung adenocarcinoma and 8 squamous cell carcinoma patients. Western blotting showed that more Annexin I was expressed in the lung tumorous tissues than in the lung nontumorous tissues, which derived from the same case. The optical density analysis showed that the ratio of expression in the tumorous tissues compared with the nontumorous tissues is 2.7 (P＜0.01). Conclusions: The expression level of Annexin I is upregulated after cell malignant transformation, and the expression of Annexin I is related to lung cancer. These results suggest that Annexin I overexpression could be a factor implicated in lung tumorigenesis. The model of α particles transformed BEP2D cell line and immortalized BEP2D cell line would offer a novel tool with which to study the function of Annexin I in malignant transformation.＜ 0.01). Conclusions: The expression level of Annexin I is upregulated after cell malignant transformation, and the expression of Annexin I is related to lung cancer. These results suggest that Annexin I overexpression could be a factor implicated in lung tumorigenesis. The model of α particles transformed BEP2D cell line and immortalized BEP2D cell line would offer a novel tool with which to study the function of Annexin I in malignant transformation.

Key words: Annexin I; Lung neoplasms; BEP2D cell

我们早期的研究表明AnnexinI基因是α粒子诱发大鼠气管上皮细胞恶性转化高丰度表达的基因之一^[1]，提示AnnexinI表达可能与细胞恶转有关。AnnexinI是一种具有多种功能的蛋白。近年来发现其表达与某些肿瘤的发生发展有关，但与肺癌的关系尚未见文献报道。本研究观察了人永生化支气管上皮细胞（BEP2D）受1.5Gy剂量的α粒子照射恶性转化后AnnexinI基因的表达变化，并首次观察了该基因在肺癌病人中的表达改变。

1材料与方法

1.1细胞培养

永生化BEP2D细胞系由美国NIH的HarrisCC教授提供^[2]，1.5Gyα粒子照射后连续培养，第35代恶转BEP2D细胞（已在裸鼠成瘤）由本实验室建立。永生化及恶转BEP2D细胞用HLC-8无血清培养基（美国，BiofluidsInc.）37℃于CO₂培养箱中培养。

1.2组织来源

来源于同一病人的正常肺组织和肿瘤组织，取材后立即冻存于液氮中，－70℃保存。临床病理诊断：8例为肺鳞癌，其中1例为高分化鳞癌，4例为中分化鳞癌，2例为低中分化鳞癌，1例为低分化鳞癌；4例为肺腺癌，其中1例为中分化腺癌，其余3例为低分化腺癌。

1.3Westernblot

1.3.1细胞蛋白提取：细胞常规培养达指数生长期时胰酶消化，接种2×10⁶个细胞于100mm培养皿培养24小时，标准方法提取^[3]，100℃煮沸变性4分钟，蛋白等量上样。

1.3.2肺组织蛋白提取：根据Masaki^[4]等的方法进行AnnexinI蛋白的纯化，并作部分修改。所有过程均在4℃中进行。称取0.5～1g肺组织，PBS洗净，于匀浆缓冲液中匀浆（10mmol/L的二硫苏糖醇，100μg/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂，1μg/ml的亮抑肽和10mmol/L的氯化钙）。静置20分钟，2900g离心15分钟，将上清转移至另一离心管中，27000g离心40分钟。沉淀重悬于BufferA中（100mmol/L氯化钠,1mmol/L二硫苏糖醇,1mmol/L氯化钙,1％TritonX-100和10mmol/L盐酸咪唑,pH7.4），震荡20分钟，25000g离心30分钟。沉淀用不含TritonX-100的BufferA洗涤两次，重悬于BufferB中（100mmol/L氯化钠,1mmol/L二硫苏糖醇,1mmol/LEGTA和10mmol/L盐酸咪唑，pH7.4），30000g离心45分钟。上清用Bradford^[5]方法定量，30μg蛋白等量上样。

1.3.3Westernblot：所有电泳装置均为北京六一仪器厂产品。N-19人AnnexinI多克隆抗体，辣根过氧化酶标记山羊抗人AnnexinI抗体，增强化学发光检测试剂盒（enhancedchemoluminescence,ECL）均购自美国SantaCruzBiotechnology公司，低分子量标准蛋白质（14.40～97.40KDa）购自上海丽珠东风生物技术有限公司。15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250凝胶染色，或100mA过夜将蛋白转移至NC膜（Hybond），Blotto封闭30分钟，分别与一抗、二抗杂交，ECL试剂与膜反应，放射自显影于X光胶片上。

1.4Northern印迹分析

细胞总RNA提取按GIBCO公司Trzol试剂盒说明书进行。取20μg总RNA甲醛变性胶电泳，真空转印至尼龙膜(Amersham)。Prime-a-Gene随机引物法合成探针(Promega)。标准方法杂交^[3]。

1.5免疫细胞化学分析

细胞常规培养达指数生长期时胰酶消化，接种5×105个细胞与预先放置盖玻片的60mm培养皿中，继续培养48小时，PBS冲洗2次，冷95％乙醇固定30分钟，DAB法染色，常规脱水，中性树脂封片。同时分别以PBS和正常山羊血清代替一抗作空白对照和替代对照。AnnexinI基因表达为细胞膜和细胞浆黄褐色染色。

1.6印迹密度及统计分析

采用基因公司的凝胶成像系统和美国UVP公司的LabWorkTM分析软件，对Westernblot和Northernblot印迹的光密度扫描分析表达量。t检验分析肺组织中AnnexinI蛋白表达差异显著性。

2结果

2.1AnnexinI在BEP2D细胞中的表达与分布

2.1.1Northern印迹分析AnnexinImRNA的表达：图1显示永生化BEP2D细胞和α粒子照射后35代转化BEP2D细胞中均有AnnexinImRNA的表达，光密度分析表明，AnnexinImRNA在恶性转化后细胞中的表达量为永生化的1.5倍。

2.1.2Western印迹分析AnnexinI蛋白质的表达：AnnexinI在永生化和α粒子照射后35代转化BEP2D细胞中均有蛋白质的表达，但转化后的细胞中AnnexinI的蛋白质表达明显高于永生化细胞，光密度分析表明两者之比为1.5（图2）。

2.1.3AnnexinI在BEP2D细胞中的分布：细胞免疫化学表明，AnnexinI在BEP2D细胞中主要分布于胞浆和胞膜上，细胞核中无AnnexinI免疫反应活性（图3）。永生化和恶转BEP2D细胞未见明显差别。<