【摘要】目的：采用细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒。方法：CD、TK融合基因CDglyTK自载体pWZLneoCDglyTK中切出，亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pAdtrackCMV-CDglyTK,将之PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdeasy-1共转化BJ5183菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA,PacI酶切后转染293细胞包装成腺病毒颗粒,采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定，利用报告GFP基因对病毒滴度和感染效率进行测定,Western Blot检测感染腺病毒的肿瘤细胞中有无目的基因的表达。结果：由pAdTrack-CMV-CDglyTK和pAdeasy-1共转化BJ5183菌16～20h后，可获得30％左右的阳性重组体细菌克隆,由重组体克隆质粒DNA转染293细胞包装产生的重组体腺病毒,经PCR检测表明已含有目的基因,且无复制能力腺病毒的存在。纯化所得腺病毒滴度约为8×1012pfu/L,当MOI=100时,腺病毒感染HepG1细胞的效率＞75％,Western Blot证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达。结论：细菌内同源重组法是一种高效、简便、快捷的重组体腺病毒载体制备方法。所制备的Ad-CDglyTK在体外能有效表达相应的基因产物,为今后的深入研究奠定了基础。

中图分类号：R735.5文献标识码：A文章编号：1000－467X(2000)05－0399－05

High efficient generation of recombinant adenovirus containing CD、TK fusion gene by using a method of homologous recombination in bacteria

WEI Dao-yan, MI Jun, CHEN Shi-shu

(Research Center for Human Gene Therapy, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, P.R.China)

【 Abstract】 Objective： To generate recombinant adenovirus (Ad) by using a novel and high efficient method of homologous recombination in bacteria with CDglyTK as target gene. Methods： CDglyTK gene was liberated from plasmid of pWZLneoCDglyTK and subcloned into shuttle plasmid and formed transfer plasmid of pAdTrackCMV-CDglyTK. Then it was linealized with PmeI and cotransformed into BJ5183 bacterial cells with adenovirus genomic DNA plasmid of pAdeasy-1. The identified recombinant adenovirus plasmid DNA was digested with PacI and transfected to 293 cells to package recombinant adenovirus particles. The PCR technique was used to detect target gene and replication-competent Ad (RCA) contamination. The titre and its infection rate of the recombinant Ad were measured with the aid of GFP expression. Western Blot technique was used to analyze the target gene expression in infected tumor cells. Results： There were over 30％ positive recombinant bacterial clones after co-transformation of BJ5183 bacterial cells with pAdTrack-CMV-CDglyTK and pAdeasy-1. Recombinant adenovirus particles were produced after 293 cells transfected with recombinant Ad genomic plasmid DNA digested with PacI, then they were further amplified in 293 cells. PCR test indicated that the recombinant Ad contained the insert of CDglyTK gene and there was no contamination of RCA in high-titer viral stocks. The titre of purified Ad was 8× 1012 pfu/L, and more than 75％ HepG1 cells were infected with Ad-CDglyTK adenoviruses when MOI reached 100. Meanwhile, protein product of CDglyTK gene was detected in the infected tumor cells. Conclusion： The method of homologous recombination in bacteria is a conve-nient and high efficient method to prepare recombinant Adenovirus, and the prepared adenoviruses can effectively madiate target gene expression in infected tumor cells, thus paves a sound foundation for further study.

Key words： Neoplasms;Cancer gene therapy; Adenovirus vector; Bacteria

恶性肿瘤的基因治疗是近年来的研究热点,高效基因转移载体和合适目的基因的选择是影响疗效的关键因素。由于重组腺病毒载体介导基因转移效率高，感染细胞谱广、病毒滴度高、易于浓缩和贮存等特点而成为肿瘤基因治疗临床试验的常用载体,当以invivo为基因转移途径,腺病毒载体则为病毒性载体中的首选^[1]。但现行常用的细胞内同源重组腺病毒载体制备方法存在着成功率低、工作量大、实验周期长等缺陷，给研究工作带来了很大的不便。在目前众多的临床肿瘤基因治疗研究方案中,自杀基因是选用较多的一类目的基因。由于肿瘤病因复杂、类型繁多，加之肿瘤又存在明显的异质性,单一基因治疗效果较差，多基因联合治疗是今后研究的方向^[2]。为此，本研究利用一种新型、高效的细菌内重源重组腺病毒制备方法，构建出同时含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因和I型单纯疱疹病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因的融合自杀基因重组腺病毒载体Ad-CDglyTK，其能在感染的肿瘤细胞中表达出相应的蛋白产物，从而为今后的深入研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

293细胞引自ATCC,HepG1肝癌细胞株为本室传代培养。BJ5183菌株、穿梭质粒pAdtrack-CMV、腺病毒基因组质粒pAdeasy-1由JohnHopkins肿瘤研究中心的Tong-chuanHe博士惠赠（质粒结构见图1）。含CD、TK融合基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglyTK由Henry Fork Health System的Rogulski博士惠赠。兔抗CD的多克隆抗体由Heidelberg大学Hacck博士惠赠惠赠,羊抗兔IgG-AP购自华美生物工程公司。LipofectAMINE,小牛血清、Opti-MEM、MEM及DMEM培养基为Gibco公司产品。

图1pAdTrack-CMV和pAdeasy-1质粒结构示意图

1.2方法

1.2.1细胞培养：293细胞用含10％小牛血清的MEM培养基在37℃，5％的CO₂培养，HepG1细胞用10％的DMEM培养基培养。

1.2.2细菌感受态的制备、质粒提取、纯化、酶切、连接及细菌转化等参见Sambrook等^[3]方法。

1.2.3重组体腺病毒载体的构建：构建流程(见图2)。

图2重组腺病毒载体构建流程示意图

1.2.3.1转移质粒的构建：目的基因CDglyTK自pWZLneoCDglyTK质粒中经EcoRI和BamHI部分酶切后，回收2.5kb的片段，亚克隆至pcDNA3质粒中，pcDNA3-CDglyTK质粒经XbaI＋KpnI酶切，回收2.5kb的目的基因片段，插入至经同样酶切的穿梭质粒pAdtrack-CMV中，构建成转移质粒pAdtrack-CMV-CDglyTK，经酶切鉴定正确后，抽提质粒DNA备用。

1.2.3.2重组体腺病毒质粒载体的构建及鉴定：取0.5～1.0μgpAdTrackCMV-CDglyTKDNA,PmeI酶切后与0.1μg的pAdeasy-1质粒混匀，加至感受态菌BJ5183中，行电穿孔法质粒细菌转化。小量抽提转化克隆菌质粒DNA，根据琼脂糖电泳电泳质粒大小，选择可疑重组体腺病毒质粒DNA，经PacI、XbaI＋KpnI酶切鉴定正确后，抽提重组体腺病毒质粒pAdeasy-CDglyTKDNA备用。

1.2.3.3重组体腺病毒的包装、扩增和纯化：重组体腺病毒质粒DNA经PacI酶切后采用LipofecTAMINE介导转染293细胞。于转染后不同时间在荧光显微镜下观察GFP表达状况，了解腺病毒包装过程。待有较明显的病毒克隆斑或蚀斑形成后，将293细胞自培养瓶内刮下，－70℃/＋37℃反复冻融3次裂解细胞，离心取含病毒的上清，重新感染293细胞大量扩增病毒。病毒的纯化参照Hitt^[4]等的方法。

1.2.4PCR对重组体腺病毒Ad-CDglyTK的鉴定：自高滴度病毒贮存液中提取腺病毒基组DNA作为模板，分别用可扩增目的基因CDglyTK和扩增腺病毒E1区的二对引物进行PCR反应，对腺病毒进行鉴定。扩增CDglyTK基因的引物：

上游引物：5'-GCGCGTTAAAGAGATGCTGGAG-3'

下游引物：5'-ATGGCGGTCGAAGATGAGGGTGA-3'

扩增E1区的引物：

上游引物：5'-TCGATCTTACCTTGCCACGC

下游引物：5'-GAGTCACAGCTATCCGTAGAC

1.2.5重组体腺病毒滴度及感染效率的测定：将浓缩后的病毒贮存液作不同比例的稀释，取400μl稀释液加至293细胞培养瓶中，放置37℃吸附30分钟，换新鲜培养基继续培养18～24h,于荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，按下列公式计算病毒滴度：

病毒感染效率测定：HepG1细胞按2×10⁵细胞/孔接种于6孔板中，用0.1、1、10、100m.o.i(multiplicityofinfection)的腺病毒感染，48小时后在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞百分率。

1.2.6重组体腺病毒的体