【摘要】目的：了解青年乳腺癌BRCA1基因突变情况，探讨BRCA1基因突变与腋窝淋巴结转移等临床病理参数的关系。方法：应用聚合酶链式反应（PCR)－变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAUGE）－DNA银染方法，研究30例＜35岁乳腺癌患者的BRCA1基因外显子2、20的突变情况。结果：检出8例突变，突变率为26.7％，5例在外显子2,3例在外显子20。腋窝淋巴结转移的乳腺癌BRCA1突变率为38.9％，而无转移者仅为8.3％。腋窝淋巴结转移率＞50％的患者，与腋窝淋巴结转移率＜50％的患者相比，前者BRCA1基因突变率显著高于后者（71.4％vs18.2％）。雌激素受体阳性的乳腺癌BRCA1突变率显著低于雌激素受体阴性乳腺癌（5.36％vs63.6％）。结论：青年乳腺癌与BRCA1基因突变存在相关性；BRCA1基因突变与腋窝淋巴结转移呈正相关，与雌激素受体阳性呈负相关；对BRCA1基因外显子2和20进行的突变分析，对乳腺癌的早期诊断、淋巴结转移和预后的判断有重要的意义。

中图分类号:R737.9文献标识码:A文章编号:1000－467X(2000)05－0446－04

The association between the mutation of BRCA1 gene and lymph node metastasis in young breast cancer patients

SUN Jing-zhong， XIAO Hu, DAI Yong, et al.

(Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Shandong Medical University,Jinan 250012,P.R.China)

【Abstract】 Objective: To detect the mutations of BRCA1 gene in young patients with breast cancer, and correlate its incidence with lymph node metastasis and other clinicopathological parameters. Methods: Polymerase chain reaction-polyacrylamide urea gel electrophoresis-DNA silver staining was used to detect the mutations in exon 2 and 20 of BRCA1 gene in 30 cases of young patients with breast cancer under the age of 35. Results: Eight mutations were identified,5 in exon 2 and 3 in exon 20. The incidence of BRCA1 mutations in patients with axillary lymph node metastasis were higher than those without metastasis (38.9％ vs 8.3％ ), and estrogen receptor positive cases had a lower incidence of BRCA1 gene than those negative one (5.36％ vs 63.6％). Conclusion: BRCA1 gene is correlated to axillary lymph node metastasis and estrogen receptor negative in young patients with breast cancer.

Key words: Breast neoplasm; BRCA1 gene; Lymph node

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一。青年乳腺癌越来越受到重视。与其它年龄组相比，临床特点有明显不同，表现在该时期整个乳腺生理性增生发育致使癌肿块不易被发现、患者的害羞心理等而延误诊治;更值得重视的是，在此期女性激素分泌旺盛,乳腺癌发展迅速,腋窝淋巴结转移早。探讨青年乳腺癌特点的内在因素，正引起重视。

1994年，学者们发现、验证并克隆了乳腺癌易感基因BRCA1^[1～3]。本课题对30例青年乳腺癌标本进行了BRCA1基因的外显子2和20的突变分析。并就BRCA1基因突变与腋窝淋巴结转移的相关性进行了定性和定量的探讨，发现青年乳腺癌发病与BRCA1基因突变有相关性，而且BRCA1基因突变与腋窝淋巴结转移有一定规律性。为阐明乳腺癌的发生发展机理、早期诊断、早期治疗及预后判断提供依据。

1资料和方法

1.1临床资料

山东医科大学附属医院1997～1998年收治的30例乳腺癌患者,年龄16～35岁，平均29岁。每例均有本院病理科的病理诊断。其中27例为浸润性导管癌，3例为髓样癌。其中25例为单侧乳腺癌，5例为双侧乳腺癌。均行乳腺癌改良根治术或根治术。36例正常人外周血，4℃放置，12小时内提取DNA。

1.2标本处理

取手术标本中肿瘤组织,经过10％福尔马林固定,石蜡包埋。

1.2.1蜡块组织DNA的提取：取蜡块3～5片(片厚10μm)，放入1.5mlE.P管中。加入1ml二甲苯，混匀，15000r/min离心1分钟，弃上清，重复一次。加入1ml无水乙醇，混匀，15000r/min离心1分钟，弃上清，重复一次。加入1ml95％乙醇，混匀，15000r/min离心1分钟，弃上清，重复一次，室温晾干。加入200μl消化液，混匀，加入PK203μl，55℃水浴过夜。取出冷却至室温，加入75μl蛋白沉淀液，混匀，15000r/min离心3分钟。移上清液至一新的E.P管中。加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃放置2～3小时。15000r/min离心5分钟，弃上清，加入1ml75％的乙醇，混匀。重复一次。室温晾干后加入适量的TE。

1.2.2DNA定量：用琼脂糖凝胶电泳法，使用DNA定量Marker(Low DNA mass ladder)进行DNA定量，将DNA稀释至20μg/μl备用。

1.2.3PCR扩增：根据基因库中BRCA1序列设计合成2对寡核苷酸引物,分别扩增BRCA1基因外显子2（E2)、20（E20），引物序列分别为：F5’TTTATCTGCTCTTCGCGTTG3’,R5’GCCTAATCTTACTAGACATG3'和F5’GACGTGTCTGCTCCACTTCC3’，R5’AGCGGCCCATCTCTGCAAAG3’。扩增片断长度分别为180bp、240bp。25μlPCR扩增体系中：5×PCR缓冲液TNK50(50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl，1.5mmol/LMgCl₂，0.1％Tris-X100)，5×dNTP5μl；5×预扩增区引物5μl；3DW7μl；DNA2μl，94℃预变性4分钟，温度降低至85℃时加入Taq多聚酶1μl，进行PCR扩增：94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，30秒；循环35次，最后保温7分钟。

1.2.4变性聚丙烯凝胶电泳分析：灌注6％变性聚丙烯酰胺凝胶。预电泳至胶面温度达到50℃左右。取2μlPCR产物，加入2μl变性加样缓冲液混匀，加样。45W电泳2～3小时。硝酸银染色，显示电泳结果。

2结果

以正常人外周血DNA为对照，用2对寡核苷酸引物分别对30例青年乳腺癌组织DNABRCA1基因外显子2和20进行扩增，产物经过变性凝胶聚丙烯电泳分析。结果检测出8例突变，阳性率为26.7％。5例为外显子2的185delAG，3例为外显子20的5385insC(见图1～2)。BRCA1突变与腋窝淋巴结转移呈正相关，而且在腋窝淋巴结转移率高的乳腺癌组织中，BRCA1突变率较高。BRCA1突变与雌激素受体阳性存在负相关，见表1。

图1BRCA1基因外显子2变性凝胶丙烯电泳分析1为正常对照；4、5为突变。

图2BRCA1基因外显子20变性凝胶丙烯电泳分析1为正常对照；3、4、5为突变。

3讨论

Wagner报道^[4]，BRCA1相关乳腺癌发病年龄平均为39.5岁，明显低于通常的乳腺癌的发病年龄。Narod等^[2]的报道提示研究青年乳腺癌与BRCA1基因的相关性对进一步认识乳腺癌有重要的临床意义。

3.1BRCA1的定位与功能

BRCA1定位于染色体17q21,约占染色体组DNA的10万个碱基范围，包括24个外显子，其中最大的外显子11约为3.4个Kb，表达7.8Kb的mRNA和1836个氨基酸的蛋白质，分子量为20万道尔顿。BRCA1蛋白的氨基酸末端含有一个在许多核酸结合蛋白中发现的锌指结构，这提示BRCA1可调节基因表达。BRCA1在DNA损伤修复中起到重要作用，是抑癌基因，与细胞周期调节、细胞分化有关。BRCA-1基因在癌变过程中的作用符合“两次事件”学说，即在家族性乳腺癌中，BRCA-1基因在生殖细胞期已经存在或发生一次突变，在乳腺组织中再次发生突变时，造成杂合性的丢失（LOH），使失活而诱发癌变。基因正常时其蛋白产物可调节细胞中其它基因，作用于调节细胞生长和分化，而突变导致缺陷蛋白的产生（即蛋白分子中的锌指区发生改变），从而导致细胞恶变。

3.2BRCA-1基因的突变频率和外显率

乳腺癌患者伴有卵巢癌家族史者BRCA1的外显率接近100％。国外文献报道青年乳腺癌的BRCA1突变率为10％～45％^[6～8]。最近研究报道^[9]，BRCA1突变率有显著的地域差异性，荷兰、德国、日本，为20％弱，以色列为47％，俄罗斯为79％。本课题对30例青年乳腺癌标本进行了BRCA1基因的外显子2和20的分析，检出8例突变，突变率为26.7％。虽然本课题样本较小，但亦能够得出青年乳腺癌与BRCA1基因突变有显著相关性的结论。对BRCA1基因进行分析研究对探讨我国青年乳腺癌的发病机理将有重要的意义。

3.3BRCA-1基因的突变的检测

由于BRCA-1基因很大，给基因的突变分析带来不便，但研究BRCA-1基因在肿瘤中的突变特点有重大意义。目前发现的突变位点有1250多个，突变位点遍布整个基因的全长，以外显子11，2，20为多见^[10～13]。外显子11片段较长（3.4Kb），给基因的突变分析带来不便。而外显子2、20较短，且185delAG和5385insC两个突变比较恒定。目前可用于检测BRCA1突变的技术很多。本课题对30例青年乳腺癌标本进行了BRCA1基因的外显子2和20的分析，采用的变性聚丙烯凝胶