【摘要】目的：研究端粒酶在胃癌及其它胃疾病中的表达情况，以评价其临床诊断意义。方法：采用TRAP法检测32例胃癌，35例胃炎，8例肠上皮化生，8例胃溃疡，2例正常胃粘膜端粒酶活性。结果：72％（23/32）胃癌组织，71％（25/35）胃炎组织端粒酶呈阳性。肠上皮化生端粒酶呈阳性率为5/8。8例胃溃疡皆为端粒酶阴性。结论：由于大多胃炎组织（71％）端粒酶呈阳性，这将影响端粒酶在胃癌临床诊断中的应用。

中图分类号：R735.34文献标识码：A文章编号：1000－467X（2000）05－0416－03

Telomerase activity in gastric cancer and other gastric diseases and its clinical implication

WANG Tian－jiao， YANG Shan－min， CHEN Yu－qiang， et al.

(Cancer Research Center， Xiamen University， Xiamen 361005， P.R. China)

【 Abstract】 Objective： To detect telomerase activity in gastric cancer and other gastric diseases for the evaluation of its clinical implication. Method： TRAP method was used to determine telomerase activity in 32 cases of gastric cancer， 35 cases of gastritis， 8 cases of intestinal metaplasia， 8 cases of gastric ulcer, and 2 cases of normal gastric mucosa. Results： Telomerase activity was positive in 72％ (23/32) of gastric cancer samples, 71％ (25/35) of gastritis tissues, and of 5 out of 8 biopsies of intestinal metaplasia . No telomerase activity was detected in 8 cases of gastric ulcer. Conclusion： Telomerase activity is unsuitable for clinical diagnosis of gastric cancer because it is also detected in majority of tissues of gastritis.

Key words： Gastric neoplasms; Gastritis; Gastric ulcer; Telomerase; Clinical diagnosis

端粒酶是一种核酸-蛋白复合体，其主要功能在于合成端粒序列以维持端粒长度的稳定性。端粒酶在绝大多数恶性肿瘤组织（90％）中表达，而在正常组织（更新组织母细胞及生殖母细胞例外）为阴性，因此它被认为是恶性肿瘤诊断的良好标志^[1]。端粒酶的重新激活被认为是胃癌发生多基因步骤中的关键步骤^[2]。正常胃粘膜（62/64^[2]，95/95^[3]）基本为端粒酶阴性，而85％（56/66^[2]，85/95^[3]，23/26^[4]）胃癌组织表达端粒酶活性，因此端粒酶活性被认为是胃癌临床诊断的良好指标。胃癌中端粒酶发生率与年龄、性别、肿瘤分期、组织分型、DNA倍性、K-RAS突变不相关，胃癌端粒酶阳性患者与胃癌端粒酶阴性患者总生存率无明显差异^[3]。但也有报道认为：非整倍体胃癌细胞端粒酶活性高于二倍体胃癌细胞^[5]。胃癌端粒酶阳性患者生存率显著低于胃癌端粒酶阴性患者^[2，5]。伴有肝转移的胃癌患者端粒酶活性明显高于无肝转移的胃癌患者的端粒酶活性^[5]。此外，66例胃癌活检组织中有14例（21％）有端粒长度的改变（缩短或延长），这14例皆为端粒酶阳性^[2]。对人端粒酶RNA（humantelomeraseRNA，hTR）在胃癌组织和非癌性粘膜中的表达研究表明：81％（21/26）患者其胃癌组织hTR表达水平高于相应的胃粘膜组织^[4]。也有人检测淋巴结中端粒酶活性和hTR表达水平以期检测恶性肿瘤的隐蔽转移^[6]。本文研究端粒酶在胃癌及其它胃疾病中的表达情况以评价其临床诊断意义。

1材料和方法

1.1活检组织和细胞来源

胃癌、胃炎、胃溃疡、肠上皮化生和胃粘膜临床活检标本取自在厦门市第一医院、厦门市中山医院和解放军第174医院进行胃镜检查或手术的未经治疗的患者。标本取材中，剔除出血或坏死部分，并立即于－70℃冻存（短期使用可冻于－20℃）。所有病例均经病理证实，根据WHO标准进行分型。

四株胃癌细胞株MGC-803、BGC823、SGC7901和MKN45（引自厦门大学肿瘤细胞工程国家重点专业实验室）接种于含10％新生牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液的培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养。培养细胞收集后置于-70℃冻存（短期使用可冻于－20℃）。

1．2端粒酶提取^[1]

取组织25～50mg或10⁴～10⁶细胞，用冷的洗涤缓冲液[10mmol/LHepes-KOH(pH7.5),1.5mmol/LMgCl2,10mmol/LKCl，1mmol/LDTT]洗涤两次,然后加50μl冷的裂解缓冲液[10mmol/LTris-HCl(pH7.5), 1mmol/LMgCl2, 1mmol/LEGTA, 0.1mmol/LPMSF, 5mmol/Lβ merca ptoethanol,0.5％CHAPS,10％glycerol]，匀浆，冰浴30min。裂解物于4℃，14000g离心20min，取上清冻存于－70℃。端粒酶提取物蛋白浓度采用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定。

1．3端粒酶活性测定

端粒酶活性通过PCR-based-TRAP法进行检测^[1,7]。简述如下：50μlPCR反应体系中含：20mmol/LTris-HCl(pH8.3),1.5mmol/LMgCl₂,63mmol/LKCl,0.005％Tween-20,1mmol/LEGTA,50μmol/Ldeoxynucleosidetriphosphates(Pharma-cia),0.2～0.4μlα-³²PdATP(370GBq/L，111PBq/mol),50pmolTS引物(5’-AATCCGTC-GAGCAG-AGTT-3’),2UTaqDNA聚合酶(Sangon),端粒酶提取物（含6μg蛋白），50pmolCX-ext引物(5’- GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’)。其中CX-ext引物与体系中其它组分用石蜡小丸隔开。该体系于25℃，30min在TS末端进行端粒序列的合成，90℃,2min进行端粒酶灭活，然后按如下程序：94℃30s，50℃30s，72℃1.5min进行31个PCR循环扩增。取20μlPCR扩增产物于12％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，用X-光片进行放射性曝光，显影。根据电泳图谱的DNA梯状带（相差6bp）判断端粒酶活性。

1．4统计学处理

端粒酶活性与胃癌患者性别、年龄、病理组织分型的关系，胃炎与胃癌端粒酶活性的差异采用t检验和χ²检验进行统计学分析。

2结果

2.1胃癌及其它胃疾病的端粒酶活性

对正常胃粘膜、胃癌及其它胃疾病（胃炎、胃溃疡、肠上皮化生）活检组织端粒酶活性检测表明：2例正常胃粘膜端粒酶为阴性。四株胃癌细胞株MGC-803、BGC823、SGC7901和MKN45都表达强的端粒酶活性(见图1)。72％（23/32）胃癌组织端粒酶为阳性，包括管状腺癌（11/13）、低分化腺癌（7/8）、乳头状腺癌（2/3），印戒细胞癌（2/4）、未分化腺癌（1/1）和粘液腺癌（0/3）。在其它胃疾病中，71％（25/35）胃炎组织表达端粒酶活性，其中包括慢性浅表性胃炎（23/33）和萎缩性胃炎（2/2）。8例肠上皮化生患者有5例为端粒酶阳性。在8例胃溃疡患者中未检测到端粒酶活性。

图1胃癌和胃炎端粒酶活性

1：MGC－803细胞端粒酶活性

2：阴性对照（MGC－803细胞端粒酶经RNase预处理）

3：BGC823细胞端粒酶活性

4～7：胃癌活检组织端粒酶活性

8～11：胃炎活检组织端粒酶活性

2．2端粒酶检出率与其临床病理参数的关系

胃癌端粒酶阳性患者平均年龄为54.5(34～82)岁，阴性患者平均年龄56.5(25～80)岁，经t检验二者无显著差异（P＞0.05）。男性胃癌患者端粒酶阳性率为20/27，女性胃癌患者端粒酶阳性率为3/5，经χ²检验二者无显著差异（P＞0.05）。对管状腺癌（11/13）和低分化腺癌（7/8）进行χ²检验表明：二者端粒酶发生率无显著差异（P＞0.05）。由于乳头状腺癌、印戒细胞癌、未分化腺癌和粘液腺癌样本数太少，不具有统计学意义，因此未对其进行统计学检验。对胃癌端粒酶阳性率（23/32）与胃炎端粒酶阳性率（25/35）进行χ检验表明二者无显著差异（P＞0.05）。

3讨论

端粒酶活性被认为是胃癌临床诊断的良好指标^[2，3，4]。我们的结果表明：72％（23/32）胃癌组织端粒酶呈阳性，其中管状腺癌和低分化腺癌（11＋7/13＋8，86％），与前人报道基本一致^[2，3，4]。我们的结果还显示71％（25/35）胃炎组织端粒酶也为阳性。在我国，胃炎是一种非常普遍的疾病。这将影响端粒酶作为胃癌临床诊断的标志物，导致高假阳性的出现。我们的结果提示在应用端粒酶作为恶性肿瘤临床诊断标志时，应考虑其它干扰因素如炎症，细胞增生等。目前尚不知胃炎与胃癌之间端粒酶活性是否存在显著的量的差异，这有待于应用半定量的端粒酶检测方法进一步研究。以上结论并不否认端粒酶可能在肿瘤发生中起着重要作用。胃炎组织中可检测到端粒酶活性，这可能是因为：(1)端粒酶活性来源于炎症细胞：炎症会导致炎症细胞的浸润，而激活的淋巴细胞具有端粒酶活性^[8]。此外，96％(93/97)正常的淋巴结表达低的端粒酶活性，并被认为这来源于被激活的淋巴细胞