【摘要】目的：克隆食管鳞癌细胞EC8712分化过程中受ATRA调控的靶基因。方法：采用AP-PCR技术从食管鳞癌细胞EC8712中克隆受ATRA调控的差异表达基因片段，并测序及作同源分析，采用Northern杂交进行验证。结果：分离到在食管癌细胞分化过程中表达下调的一基因片段。该基因从ATRA处理一天开始表达被明显抑制，这种抑制持续整个诱导过程。该片段被克隆于pGEM-T载体并测序。同源分析结果表明，该基因片段与人N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）基因高度同源（IDENTITY：99％），为人NSF基因片段。NSF基因在真核细胞囊泡转运系统中发挥着重要作用。结论：参与囊泡转运的NSF基因在食管癌细胞分化过程中发挥着重要作用，NSF表达的抑制是囊泡转运系统转运活性下降的分子机制。

中图分类号：R735.1文献标识码：A文章编号：1000－467X（2000）05－0395－04

Esophageal squamous carcinoma cell differentiation-related gene N-ethylmalimide sensitive factor (NSF)

ZHANG Rui, WANG Xue-jiao, WU Min, et al.

(National Laboratory of Molecular Oncology, Department of Cell Biology,Cancer Institutue, PUMC＆ CAMS, Beijing 100021, P.R. China)

【Abstract】 Objective： To clone ATRA-regulated gene in esophageal squamous cancer cell line EC8712. Methods： By using AP-PCR technique, differentially expressed gene fragments (ESTs) were isolated from ATRA-treated EC8712. Cloning, sequencing and homology analysis were carried out to characterize an isolated differentitally expressed gene fragment. Results： The differentially expressed gene fragment was isolated, cloned and sequenced, the gene expression was inhibited during whole ATRA-treatment period, from first day to 9th day. Homology analysis revealed that the fragment derives from human N-ethylmalimide sensitive factor (NSF) gene, which is involed in vesicle transportation, expresses in various tissues, and plays important roles in differentiation of cells. Conclusion： The decrease in activity of cellular vesicle transportation plays important roles in cellular differentiation process. Down-regulation of NSF might contribute to decreased activity of vesicle transportation and differentiation of human cancer cell.

Key words： Esophageal neoplasmas; Cell differentiation

维甲类物质可有效地抑制食管癌的发生[1]，同时作为重要的分化诱导剂，已被用于白血病的分化治疗[2]。我室对全反式维甲酸（All-transRetinoicAcid,ATRA）诱导肿瘤细胞分化的分子机制进行了一系列研究，已分离出若干肿瘤分化相关基因[3～5]。分离肿瘤分化相关基因对深入探讨肿瘤细胞分化的分子机制和进行癌症的基因治疗具有重要意义。本工作采用AP-PCR技术分离到一表达受ATRA抑制的基因片段。同源分析表明，该基因片段来自参与细胞内囊泡转运的人N-乙基马来酰亚胺张睿，等.N-乙基马来酰亚胺敏感因子NSF与食管鳞癌细胞分化有关敏感因子（NSF）基因。

1材料和方法

1.1细胞及引物

人食管癌细胞系EC8712，本室建株并传代培养。组织类型为鳞癌，TNM分期为T3N0M0。

引物AP2：5-GGAAACAGCTATGACCATG-3

1.2全反式维甲酸诱导食管鳞癌细胞

将ATRA溶于含10％DMSO牛血清中，配成10^－3mol/L的贮存液。M199培养基含15％小牛血清，正常培养的食管鳞癌细胞EC8712以80万/瓶传代，24小时后，将细胞分为三组，分别加入10－4mol/L的ATRA、1％DMSO或正常培养基。各组细胞均每天换液，在处理1、3、5、7、9天收获细胞，提取总RNA。

1.3逆转录反应

按照Superscript Preamplification System for First Strandc DNA Synthesis（GIBCO/BRL）试剂盒说明书进行。20μl逆转录反应体系中含3μg总RNA，0.5μgoligo(dT)12～18，逆转录反应完成后，采用RNaseH处理。

1.4AP-PCR反应

按照参考文献[6]进行AP-PCR反应。采用Prep-A-Gene DNA Purification Systems（Bio-Rad）回收差异片段，采用Promega公司的pGEM-Tvectorsystem将PCR产物克隆于pGEM-T载体，按照操作说明操作。

1.5细胞及组织总RNA提取

按照GIBCO公司TRIZOL试剂操作说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量后，－70℃保存。

1.6Northern杂交

Northern印迹：按照分子克隆实验指南[7]进行。总RNA样品30μg变性后迅速置于冰上冷却，1.2％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。采用毛细管虹吸法将RNA转移至Zeta-Probe尼龙膜上，转膜液为10×SSC，转膜结束后用GSGeneLinker(Bio-Rad)固定RNA。

探针同位素标记：采用Prime-a-GeneLabelingSystem(Promega)标记探针，按操作说明书进行。DNA用量为25ng，同位素α-³²P-dCTP用量为50μCi。

杂交：RNA印迹的尼龙膜放入杂交袋，按350μl/cm²膜加入杂交液（1mmol/LEDTA,pH8.0,0.25mmolNa₂HPO₄，pH7.2，7％SDS），65℃预杂交30min，弃去杂交液。按照150μl/cm²膜重新加入杂交液，并加入变性的同位素探针，65℃杂交16～20h。1mmol/LEDTA,40mmol/LNa₂HPO₄,5％SDS,65℃洗膜2次，每次15～30min，1mmol/LEDTA,40mmol/LNa₂HPO₄,1％SDS,65℃洗膜2次，每次15～30min。放射自显影分析结果。

2结果

2.1分化诱导过程中差异表达基因的分离、克隆和鉴定

采用AP2引物进行AP-PCR，结果显示(图1)：与对照组相比,ATRA处理后1、3、5、7和9天一基因片段表达明显下降，该基因片段长度约580碱基。

图1 AP-PCR结果差异表达基因片段（箭头）

C：对照组;R：ATRA处理组；D：DMSO处理组。下标数字为处理天数。

M：λDNA/ECOR1＋HindIII分子量marker

将差异条带用刀片切出回收DNA，并克隆于GEM－T载体,自动测序仪测序。结果如下：

cDNA片段序列,589bases

1ggaaacagctatgaccatgattgagaacagcattttagagattcaatgcc

61ttgtttcttcaggcaaagagaataccagtcttgtgggagacctttaacca

111aatacccagtgacttttagtgttagctcaggacagctgtcagaggatctc

161tggcccacacctcgatttactaagccagatttgcatgtagaaagtctgcc

211ttctaatcggccaactgttgtcatgcaacattcatgacactgactgagag

261ttatcaagggtgatggtgctagtagagaggttgaaacgtgtagtgtccac

311aagtactggatggttcccacccagagggactgagcaagaaggaatcactt

361tagcctgcatgggaaggtaagcgcagcattctaaaccaaattgacacctt

411ccacgagacactaagctatctcagtatgcataaggaagggagttttattg

461cactaatcatgcagagcgagcacatgttgaaggtagagaacgttccactt

511agtccagtatcttgagtaagacagtgaagatcctaggccatcctcacctt

561ggtcacttcccatggtcatagctgtttcc

同源比较结果如下：

gb|AF102846.1|AF102846HomosapiensN－ethylmaleimide－sensitivefactor(NSF)mRNA,

completecds.

Length=3348Identities=563/566(99％)

Score=1098bits(554),Expect=0.0 Strand=Plus/Minus

Query：3AAACAGCTATGACCATGATTGAGAACAGCATTTTAGAGATTCAATGCCTTGTTTCTTCAG62

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：2938AAACATCTCTGACAATGATTGAGAACAGCATTTTAGAGATTCAATGCCTTGTTTCTTCAG2879

Query：63GCAAAGAGAATACCAGTCTTGTGGGAGACCTTTAACCAAATACCCAGTGACTTTTAGTGT122

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct：2878GCAAAGAGAATACCAGTCTTGTGGGAGACCTTTAACCAAATACCCAGTGACTTTTAGTGT2819

Query：123TAGCTCAGGACAGCTGTCAGAGGATCTCTGGCCCACACCTCGATTTACTAAGC