【摘要】目的：Dukes'B期大肠癌患者手术后5年生存率为53.9％～84.9％,有部分患者5年内出现局部复发或/和远处转移。本研究旨在探讨淋巴结微小转移灶(lymph nodes micrometastasis， LMM)的表达对评估经手术切除原发肿瘤及肠周淋巴结的Dukes'B期大肠癌患者预后的重要性和指导术后治疗的意义。方法：收集52例Dukes'B期大肠癌患者手术切除的淋巴结石蜡标本,同时获得这些病例的临床资料及随访（生存期大于5年或死亡）资料；实验方法：以细胞角蛋白单抗(anti-cytokerratin AE1/AE3)为探针,采用免疫组化SAP(streptavidin-alkaline phosphatase)法检测淋巴结中的LMM。结果：测52例Dukes'B期大肠癌患者的淋巴结中LMM＋组11例(21.15％),LMM-组41例(78.85％)。在38例生存期大于5年的患者中LMM＋占13.2％(5/38,)LMM-占86.8％(33/38)。χ²检验P＜0.05,生存分析log-rank检验P＜0.05；说明LMM＋组的生存期明显短于LMM-组。本实验中一般因素(性别、年龄及肿瘤所在部位)对LMM检测结果的影响不明显；统计学处理，P＞0.05。结论：用免疫组化法检测Dukes'B期大肠癌患者经手术切除后肠周淋巴结中的微小转移灶对判断患者预后及指导术后治疗均有意义，值得在临床应用。

中图分类号：R735.34;R73-37文献标识码：A文章编号：1000－467X（2000）05－0481－04

The clinical study on lymphnodes micrometastasis of stage Dukes'B colorectal cancer

ZHANG Li-ping, BAO Yun-hua, WU Jin-dong, et al.

（Deparment of Radiooncology, Vavy General Hospital, Beijing 100037,P.R.China）

【Abstract】 Objective： Patients with Dukes'B (transmurally invasive, lymph node negative) colorectal cancer have a postoperative 5-year survival rate of about 53.9％ to 84.9％ . It means that part of the patients appears local relapse or/and distant metastasis in the period of 5 years. The object is to clinical significance of investigate the lymph node micrometastasis (LMM) for prognosis and postoperative treatment. Methods： The paraffin-embedded lymph nodes samples from 52 patients were collected. The clinical material and follow-up information the patients were obtained. The immunocytochemical staining method of streptavidin-alkaline phosphatase (SAP) was applied to detect the micrometastasis in lymph nodes using the monoclonal antibody AE1/AE3, which is specific for cytokeratin antigens. Results： Micrometastases (LMM＋ ) were detcted in 11(21.15％ ) out of 52 patients. There were 13.2％ (5/38) LMM＋ and 86.8％ (33/38) micrometastasis negative (LMM-) in 38 patients of more than 5-year survives. χ² test,P＜0.05. Survive analysis by log- rank test, P＜ 0.05. Micrometastasis in lymph nodes was associated with decreased survival time in patients with Dukes＇B colorectal cancer. However, micrometastasis was not affaeted by of the sex, age patient and location of the carcinoma (P＞0.05). Conclusions： Micrometastases in lymph nodes in patients with Dukes'B colorectal cancer obviously influence survival time. The detection of micrometasbasis is for guiding postoperative treatment.

Key word： Dukes'B colorectal cancer; Immunohistology; Lymph nodes mirometastasis; Cytokeratin

我国的大肠癌发病率、死亡率亦呈逐年上升趋势。欲提高大肠癌的长期生存率，提高早期诊断率和准确、客观地判断预后是关键所在^[1]。目前临床上广泛应用Dukes^[2]分期。在此分期中，肠周淋巴结有无癌转移是其肿瘤分期、治疗及评价的重要依据^[3,4]。Dukes'B期患者5年生存率各家报道在53.9％～84.9％^[4],因此有人提出了隐匿的微小转移灶（直径小于2mm）这一概念^[5]，只是用常规病理学方法很难检测到。近年来，随着分子生物学技术的发展和应用，尤其是细胞骨架之一细胞角蛋白(cyto-keratin,CK)[6]的深入研究，上皮系统肿瘤特异性抗体的研究日趋完善。国内外不少学者应用免疫组化法、PCR法、放射性同位素示踪法等大大提高了检测的敏感性和特异性，在大肠癌患者的标本及/或活体上证实了淋巴结中存在的微小转移灶，并因此改变了患者的分期和治疗方案及预后。对指导临床工作有重要意义。

1材料与方法

1.1病例入选条件

①均为结直肠癌经手术完整切除原发灶及肠周淋巴结清扫术后患者。传统病理检查为Dukes'B期(肿瘤穿透肌层到达浆膜下层未达到结肠周腹膜或直肠周组织;无区域淋巴结转移)。②随访时间均超过5年；最长者达10年。③死亡病例患者均死于与肿瘤有关的疾病,包括复发、转移等所致死亡的病例,而术后并发症、心梗、脑出血等所致死亡的计为无效病例。④有淋巴结及原发灶的石蜡标本。⑤LMM＋＋＋＋被认为是漏检或误诊病例,应为N1或N2而不是N0病例,计为无效病例。⑥仅有原发灶标本而无淋巴结标本的病例,因无法得知是否为LMM＋＋＋＋,计为无效病例。

本实验最终符合以上6条入选条件的病例为52例,（共检测原发灶52个，淋巴结453个）。其中男性33例,女性19例;大于60岁的37例,小于60岁的15例;肿瘤位于结肠的25例,直肠的27例;5年生存率为73.1％(38/52)。

1.2实验材料

1.2.1标本：收集到52例Dukes'B期结直肠癌手术切除的淋巴结及原发灶的石蜡包埋标本(标本来源于军事医学科学院附属医院),常规制成4μm厚石蜡切片。

1.2.2试剂：①一抗：细胞角蛋白鼠抗人单抗AE1/AE3。②SAP试剂盒：包括生物素标记的兔抗鼠IgG二抗工作液、碱性磷酸酶标记的链酶卵白素三抗工作液以及封闭用山羊血清工作液。(①②均由美国DAKO公司生产,购自北京中山生物技术有限公司)③免疫组化实验一般试剂：TBS液;TB液;枸橼酸缓冲液;10％羊血清;0.4％胃蛋白酶。④显色剂坚固红工作液。

1.3实验方法

第一天：淋巴结4μm切片55℃烘烤过夜。第二天：①将切片放入二甲苯原液3瓶,脱蜡。②梯度酒精(脱二甲苯)。③加胃酶液37℃孵育。④微波加热(抗原热修复)。⑤在②③④后均用0.05mol/LTBS液3瓶各洗5分钟。⑥加10％羊血清温箱中孵育。⑦加AE1/AE3一抗,4℃冰箱过夜。第三天：①过夜后标本用0.05mol/LTBS液3瓶各洗5分钟。②加二抗后温箱中孵育35分钟并重复①。③加三抗后温箱中孵育35分钟并重复①。④坚固红液显色25分钟左右。⑤清水涮洗后苏木素瓶内1分钟。⑥用封片胶封片。

1.4判断标准

CK抗原定位于细胞浆内,阳性细胞为玫瑰红色,阴性细胞不着色。淋巴结内发现CK标记的细胞,结合组织结构和细胞形态,确定为肿瘤微小转移灶阳性(LMM＋)。一个淋巴结内肿瘤细胞0个为－,1～5个为＋(图1a),6～25个为＋＋(图1b),26～50个为＋＋＋(图1c),51个以上为＋＋＋＋(图1d)。＋＋＋＋者考虑为漏诊,即常规病理染色应能发现的转移灶。故不能以微小转移灶计算，计为无效病例。

图1免疫组化SAP方法，坚固红染色，显示CK抗原定位

a.LMM＋,阳性细胞为玫瑰红色，数目1～5个，×200；b.LMM＋＋，阳性细胞为玫瑰红色，数目6～25个，×400

c.LMM＋＋＋，阳性细胞为玫瑰红色，数目26～50个，×400；d.LMM＋＋＋＋，阳性细胞为玫瑰红色，数目＞50个，×400

图2LMM＋组及LMM－组生存曲线比较

1.5统计学分析

临床一般情况进行χ²检验,生存情况进行log-rank检验,并用Kaplan-Meier曲线表示。

2结果

2.152例Dukes'B期结直肠癌患者LMM检测结果

LMM＋组占21.15％(11/52);LMM-组占78.75％(41/52)。检测的453个(平均9.1个/例)淋巴结中22个(4.85％)阳性。

2.238例生存期大于5年患者LMM检测结果

LMM＋组占13.2％(5/38);LMM-组占86.8％(33/38)。χ2检验P＜0.05。

2.314例死亡患者复发或转移情况

肺转移4例;局部复发4例;肝转移3例;肺及肝转移2例;肺转移及局部复发1例。

2.4LMM对生存期的影响

检测52例Dukes'B期(肿瘤穿透肌层到达浆膜下层未达到结肠周腹膜或直肠周组织;无区域淋巴结转移)结直肠癌患者5年生存率为73.1％(38/52),淋巴结中LMM＋组11例,LMM＋组5年生存<