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分类号：R730.43文献标识码：A
文章编号：1000－467X（2000）03－0200－04
The detection of mdr－1 gene expression using fluorogenic probe quantitative RT－PCR method
GAO Jing－songet al.
（Daan Gene Diagnosis Center of Sun Yat－sen University of Medical Sciences， guangzhou 510089， P.R.China）
mA GangTONG Ming（Cancer Center of Sun Yat－sen University of Medical Sciences， Guangzhou510060， P.R.China ）
Abstract：Objectives： To establish a fluoregenic probe quantitative RT－PCR(FQ－RT－PCR) method for detecting the expression of mdr－1 gene in tumor cells and comprehend the expression of mdr－1 gene in patients with lung cancer. Method： The fluorogenic quantitative RT－PCR method for detecting the expression of mdr－1 gene was established successfully. K562/ADM， k562 cell line or forty－five tumor tissues from patients with lung cancer， were detected in the PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector. Results： after ten duplicate tests with FQ－RT－PCR method， the average level of the mdr－1 gene expression was( 6.86± 0.65)× 10 7copies/μ g RNA from K562/ADM cells and (8.49± 0.67)× 105 copies/μ g RNA from K562 cells， respectively， the former was 80.8 times greater than the latter，the coefficient variation(CV) was 9.5％ and 7.9％ ， respectively. Of forty－five patients with lung cancer， 12 cases expressed of mdr－1 gene at various levels. Conclusions： the mdr－1 gene expression detected with the FQ－RT－PCR could be gotten an accurate quantitative result and the gene expression level be judged easily. moreover， low levels of mdr－1 gene expression were observed in twenty－five percent of the patients with lung cancer.
Key words：Fluorogenic quantitative detecting； RT－PCR； mdr－1 gene； Gene expression▲
常规检测mdr-1基因表达，多采用竞争RT-PCR法和内源性参比基因RT-PCR定量法[1，2]；它们均属于PCR终点检测法，在PCR扩增的指数期和平台期产量相差极大，很难对起始模板数准确定量。此外，常规的RT-PCR方法还存在因产物污染而导致的假阳性、非特异性扩增、扩增后电泳操作造成误差（对同样的标本可有高达3～10倍的差异）及EB染液对人体有害等问题，妨碍了其在临床中的推广应用。
新近出现的荧光定量PCR是PCR技术一个重大突破。该方法是在完全闭管的情况下，对PCR扩增产物进行检测，既彻底杜绝了PCR产物污染造成的假阳性问题，又能够对标本起始模板做到精确定量，已逐步成为PCR更新换代的新技术[3，4]。1997年我们于国内首先建立了荧光定量PCR技术，在此基础上，我们开展了荧光定量RTPCR检测肿瘤mdr1基因表达的研究，现报道如下。
1材料与方法
1.1细胞培养
K562/ADM（阿霉素）耐药细胞株由福建省肿瘤医院沈世人教授惠赠[5]，K562敏感细胞株来自我校肿瘤医院。两细胞株在RPMI-1640(Gibco)加20％小牛血清，并含青链霉素双抗各100u/ml的培养基中，于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱内连续传代培养；K562/ADM耐药细胞株在培养时加入终浓度为3.8μg/ml的阿霉素。
1.2组织标本
45例初治病人肺部肿瘤标本采自我校肿瘤医院，为1998年5月至1998年9月手术后的肿瘤标本，均作病理检查确诊。其中鳞癌19例、腺癌15例、腺鳞癌4例、细支气管肺泡上皮细胞癌4例、肺部转移癌3例。病人年龄39～71岁（平均54.3岁）;男性28人，女性17人。
1.3细胞与组织总RNA的提取
将106～107K562/ADM耐药株和K562不耐药株细胞或上述新鲜的肺癌组织0.1～0.2g，分别各加入1mlTrizol（Gibco）试剂，操作按说明进行。提取后的RNA测A260A280吸光值，要求A260/A280比值≥2.0，并计算出RNA含量。
1.4引物、探针设计、合成、纯化
mdr-1参照文献[1]。上游引物5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'，下游引物5'-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'，扩增片段长度为167bp。自行设计探针如下：5'-CGCT-ACTGAAGCAATAGAAAACTT-3'，其中在5'端标记上荧光发光基团FAM（6-carboxy-fluore-sceinPE公司产品），3'端标记上荧光淬灭基团TAMRA(6-carboxy-tetramethylrhodaminePE公司产品)。引物探针合成纯化在我们实验室完成。
1.5cDNA合成
在反应体积为10μl的逆转录管中，含2μg提自K562/ADM耐药株及K562不耐药株细胞的总RNA或病人肿瘤标本，50mmol/LTris－Cl（pH8.3），40mmol/LKCl，7mmol/LMgCl2，1mmol/LDTT，0.01％BSA，1mmol/LdNTPs，20UMMLV逆转录酶（Sangon产品），10URNA酶抑制剂（华美公司产品），各15pmol/Lmdr-1下游引物，37℃，60min，95℃5min灭活逆转录酶。合成好的cDNA置－20℃备用。
1.6定量阳性标准模板的克隆
采用T-A载体克隆方案，参照李新波等[6]介绍的方法进行。将mdr-1167bp扩增片段克隆至pUC18质粒中，抽提、纯化重组质粒，按1010拷贝数/μl浓度存于－20℃备用。
1.7荧光定量RT-PCR
荧光定量PCR的原理是：在PCR扩增系统中加入一段与靶基因互补的双荧光素标记探针(5'端荧光素称为报告基团，3’端荧光素称为淬灭基团)，在完整状态下探针5’端报告基团发出的荧光受到了3’端淬灭基团抑制而检测不到荧光；当PCR扩增时，随着引物沿模板的延伸，Taq酶具5’-3’的外切酶活性，可将位于扩增片段内的探针5’端的荧光素切下，切下的报告基团脱离了3’端淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，切下的荧光素数量与扩增产物是一对一的关系，用检测仪检测荧光值的变化，即可准确判断扩增产物的量[3，4]。在判定结果时，用循环阈值（cyclethreshold，CT）作为临界点，该点位于PCR产物进入指数增长期的起始点。
50μlPCR反应体积中，含5XPCR反应液[50mmol/LTrisHCl(pH8.3)、10mmol/LMgCl2、250mmol/LKCl、1mg/ml明胶]10μl，mdr-1上下游引物各15pmol/L，荧光探针10pmol/L，Taq酶3U，和不同样本自100ngRNA逆转得到的cDNA，同时将定量模板梯度稀释，作标准曲线，在ABIPRISM7700型实时检测扩增仪上进行扩增，反应条件为93℃预变性3min，93℃40sec，55℃120sec共作40个循环。反应结束后用计算机将样本与标准曲线对比得出mdr-1基因表达的拷贝数。
2结果
2.1定量阳性标准模板
pUC18T载体连接mdr-1PCR片段，经蓝白斑LB平板筛选，含氨苄青霉素80u/mlLB培养基培养，提取质粒后，行PCR扩增，有特异条带出现者，用建立的FQ-RT-PCR法检测，有强烈的荧光值增长，说明mdr1基因已成功克隆，将提取的质粒测OD值，含量为1.31μg/μl，折算为4.35×1011拷贝数/μl，用TE稀释成1010拷贝数/μl备用。
2.2荧光定量RTPCR结果
PE7700型扩增检测仪在PCR反应进行的同时，每8sec检测一次PCR产物量，做到了实时检测。从图1可见，不同的标准起始模板数（107、106、105、104、103、102、101）在反应后的平台期，产物量相差不成比例，因此，采用终点法进行定量，结果会很不准确。而将检测的临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点即CT值处，由图1可见起始模板数与CT值成比例增长。将不同梯度定量模板数与其CT值关系经对数拟合作图，得到了定量标准曲线，样品与标准曲线比较就能准确反映待检样品的起始核酸量。在最佳反应条件下，1个拷贝起始模板数其CT值约为37～40，100个拷贝CT值约为30.5，因此，反应循环数定为40，可满足最低检测限的要求。
